海兰褐鸡胚胎Brachyury cDNA的克隆与序列分析

为了扩增海兰褐鸡胚胎Brachyury基因,试验采用RT-PCR的方法,根据Gen Bank中报道的原鸡Brachyury序列设计1对特异性引物,以海兰褐鸡胚胎尾芽组织提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出海兰褐鸡胚胎Brachyury的c DNA,并克隆到p MD-19T载体中,通过菌落PCR和DNA序列测定进行最终鉴定。结果表明:所克隆的c DNA为海兰褐鸡胚胎Brachyury基因的部分序列,用NCBI网站上的BLAST功能将测序结果与已发表的鸡胚胎Brachyury基因序列进行对比,1 292个碱基中仅有6个碱基有差异,同时该段c DNA包含由1 167个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码387个氨基酸残基,符合Brachyury基因特征。     

鸡下丘脑组织表达序列标签初步分析

为了鉴定所构建的鸡下丘脑组织 c DNA文库能否用于下丘脑表达谱的建立 ,从 c DNA文库中随机挑取 12个克隆 ,对其表达序列标签 (expressed sequence tags,ESTs)进行了测定和初步分析。经 BL ASTn和 FASTA3.1分析后发现 ,1个 ESTs在 Gen Bank中可以找到鸡的同源序列 ,4个在其他物种中也可以找到同源序列 ,1个在 ESTs database中有同源 ESTs序列 ,还有 6个为未知功能基因。 12个 ESTs序列均已录入 Gen Bank。     

野生乌苏里貉18SrDNA全序列的克隆测序及系统进化树分析

试验采用聚合酶链式反应方法,从野生乌苏里貉耳部肉中提取DNA,扩增出18S rDNA的全序列,并对其进行克隆测序,获得长度为1831 bp的序列,并将序列提交到GenBank上,经BLAST分析结果表明,测序得到的乌苏里貉18S rDNA与其他物种同源性均在90%以上,说明18S rDNA基因具有较高的保守性,可以作为分类学当中系统进化分析的重要参考依据。     

家鸭GHSR基因部分编码序列的克隆及变异检测

作者旨在克隆鸭GHSR基因mRNA部分编码区序列,并筛查克隆序列中的变异位点。采用RT-PCR法从巢湖鸭下丘脑组织中分离家鸭GHSR基因mRNA中编码区核酸序列,并选用30个个体cDNA,通过构建cDNA池对克隆编码区的序列变异测序检测。结果表明,克隆鸭GHSR基因mRNA部分编码区核酸序列长635 bp(GenBank登录号:EU005225),编码211个氨基酸,与鸡GHSR基因同源核酸相似性达到94%,氨基酸相似性为97%;cDNA池测序检测揭示克隆区段存在3个碱基变异位点,均为同义突变,未使编码氨基酸发生改变。克隆鸭GHSR基因mRNA编码区核酸、氨基酸序列与鸡同源序列的相似性,以及克隆核酸序列的变异检测结果表明,鸭GHSR基因在序列和功能上具有很高的保守性。     

鸡MBL2基因生物信息学分析及组织表达

为了研究鸡甘露聚糖结合凝集素的特征与功能，本试验通过PCR技术扩增莱航鸡MBL2基因序列，并通过生物信息学软件分析鸡MBL2基因的基本特征，并预测其功能、构建蛋白互作网络；构建真核表达载体并注射小鼠，在小鼠肝脏中进行瞬时表达；制备多克隆抗体，采用免疫组织化学技术，检测MBL-C蛋白在鸡体内的组织分布。结果显示，莱航鸡MBL2基因全长765 bp，编码254个氨基酸；MBL-C蛋白分子式为C₁₁₉₂H₁₉₂₇N₃₃₃O₃₇₉S₁₃，具有信号肽；蛋白分子结构由α螺旋、β转角、延展链以及无序结构构成；进化分析显示鸡MBL2蛋白符合生物进化规律；富集分析显示该蛋白参与补体活化过程，组成细胞外区域，与内肽酶及水解酶活性有关；蛋白互作网络显示MASP1/2、LOC418892等蛋白与MBL2有互作关系；免疫组化结果证实鸡MBL-C蛋白主要由肝脏分泌，其表达量随日龄增加升高。     

鸡IL-2基因的克隆及GST-chIL2融合蛋白的表达

根据Sundick等发表的鸡IL-2基因(chIL2)序列设计合成特异性引物,用RT-PCR从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞扩增出450 bp的目的片段,酶切鉴定及序列测定结果表明为鸡IL-2基因。该基因包括鸡IL-2基因的全部开放阅读框,编码142个氨基酸组成的蛋白质,与GenBank鸡IL-2基因相比,在编码氨基酸的49位有一个氨基酸缺失;而与Broiler、SC、Chenren和Xiaoshan鸡在编码氨基酸上完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel来航鸡、来航SPF鸡、Obese、Silky和Xianju鸡等有1-4个氨基酸的差异;与火鸡和鹌鹑的氨基酸同源性分别为69.9%和59.4%。将克隆到的基因插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-6p-1中,得到重组表达质粒pGEX-IL2。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,表达出了大小约为40 ku的GST-chIL2融合蛋白,其中GST部分为26 ku,鸡IL-2为14 ku,与预期的鸡IL-2成熟蛋白大小一致。     

藏鸡副鸡嗜血杆菌的分离及16S rDNA序列分析

四川省某藏鸡场藏鸡发生以鼻腔与窦发炎、颜面肿胀、流鼻涕和打喷嚏为主要特征的疾病,通过对送检病鸡病原的分离纯化、生化鉴定、16 S rDNA基因的克隆和序列分析诊断为副鸡嗜血杆菌感染,将该株副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA序列与GenBank中15株巴氏杆菌科菌株进行同源性分析发现,与6株副鸡嗜血杆菌同源性较高,为94.2%～97.2%,与其它菌株16 S rDNA基因的同源性较低。另外,药敏试验表明,本菌株对菌必治、阿莫西林、庆大霉素、头孢氨噻肟和阿奇霉素等药物敏感。     

鸡白细胞介素-17基因的克隆和序列分析

根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17（ChIL-17）基因的cDNA序列设计了1对特异性引物，以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp，其中第2～508位是该基因的阅读框（ORF），共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较，二者核苷酸序列的同源性为99．6％（722／725），共有3个碱基发生变异，其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为100％。同时，以鸡脾淋巴细胞DNA为模板，用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列，经序列分析，其序列全长1934bp，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子分别位于第2～27、569～815和1484～1720bp处。     

16S rRNA基因联合gyrB、grpE、recA基因对鸡源鲍氏志贺菌hn03株进行分子起源分析

为了从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌,分别根据GenBank中登陆的相应序列针对16srRNA、gyrB、grpE、recA4基因设计4对引物,用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌4基因的部分片段并进行了克隆测序。将所获序列与GenBank中同源性较高的相关序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。研究发现,从4基因的序列分析结果总体上可知鸡源志贺菌与人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99．6％～100％。几乎所有志贺菌均落入大肠杆菌的分支中,且在鉴别细菌中recA基因和gyrB基因比传统中常用的16S rRNA基因差异更显著。由此证明用细菌分类和鉴定的“金标准”16S rRNA联合gyrB、grpE、recA3个基因进行序列分析来鉴定志贺菌是一种可靠、成本较低的方法;由上述基因序列构建的系统发育树提示,该株鸡源志贺菌可能是与人志贺菌密切相关的新种或是它们的亚种。     

大熊猫蛔虫ITS及5.8SrDNA序列的克隆与分析

基于核糖体DNA第一与第二转录间隔序列以及5.8S序列,以分离自广州动物园大熊猫体内的蛔虫为研究对象,用保守引物NC_5和NC_2对核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区ITS-1,ITS-2及5.8S序列进行PCR扩增,扩增后的片段纯化后克隆至pGEM-Teasy载体,重组质粒通过菌液PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定及分析,鉴定大熊猫蛔虫的种类。结果显示,目的片段总长为910 bp,2个不同样品之间的ITS及5.8S序列没有差异,与GenBank~（TM）中的拜林蛔线虫（Baylisascaris transfuga）、猪蛔虫（Ascaris suum）和人蛔虫（Ascaris lumbricoides）的ITS序列相似性分别为96.6%、82.9%和82.7%。结果表明,此次分离的大熊猫蛔线虫可能为拜林蛔线虫。     

斑鼻羚毛首线虫ITS序列的PCR扩增及分析

以茂名野生动物园斑鼻羚体内分离出的毛首线虫为研究对象,用保守引物PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和5.8 S序列,并进行克隆、转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定.结果获得2个毛首线虫样品的ITS及5.8 S rDNA序列,总长为1 316 bp,样品间序列相似性为99.2%.将序列与G...     

进境太平洋鳕鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS 序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻太平洋鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,进行克隆、转化、测序和序列分析,并对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为906 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(353 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(299 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank登录的伪新地蛔线虫(Pseudoterranova decipiens)同源性均为在99.7%以上,与其他线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从鳕鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与伪新地蛔线虫处于同一分支。本研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步的分子生物学研究奠定基础。     

Molecular detection of Babesia bovis and Babesia bigemina in white-tailed deer (Odocoileus virginianus) from Tom Green County in central Texas

Serologic and molecular evidence suggest that white-tailed deer in South Texas and North Mexico carry the agents of bovine babesiosis, Babesia bovis and Babesia bigemina. To determine if white-tailed deer in central Texas, which is outside the known occurrence of the vector tick at this time, harbor these parasites, blood samples from free-ranging and captive white-tailed deer (Odocoileus virginianus) in Tom Green County were tested by polymerase chain reaction (PCR) assays for B. bovis and B. bigemina 18S rDNA. Of the 25 samples tested, three (12%) were positive by nested PCR for B. bovis. This identity was confirmed by sequence analysis of the cloned 18S rDNA PCR product. Further confirmation was made by sequence analysis of the rRNA internal transcribed spacer (ITS) 1, 5.8S rRNA gene, and ITS 2 genomic region in two (representing samples from two different ranches) of the B. bovis positive samples. Three samples were positive by B. bigemina nested PCR, but sequencing of the cloned products confirmed only one animal positive for B. bigemina; Theileria spp. DNA was amplified from the other two animal samples. In addition to Theileria spp., two genotypically unique Babesia species sequences were identified among the cloned sequences produced by the B. bigemina primers in one sample. Phylogenetic analysis showed no separation of the deer B. bovis or B. bigemina 18S rDNA, or deer B. bovis ITS region sequences from those of bovine origin. Clarification of the possible role of white-tailed deer as reservoir hosts in maintaining these important pathogens of cattle is critical to understanding whether or not deer contribute to the epidemiology of bovine babesiosis.     

Improved polymerase chain reaction technique for determining the species composition of Eimeria in poultry litter

An improved polymerase chain reaction (PCR)-based method for determining the species composition of Eimeria in poultry litter was developed by incorporating species-specific internal standards in the assay. Internal standard molecules were prepared by fusing seven different Eimeria species-specific intervening transcribed sequence 1 (ITS1) rDNA primer pairs to a non-Eimeria DNA molecule and by cloning the hybrid DNA molecules into a plasmid. The internal DNA standards were then used in Eimeria-specific ITS 1 PCR, and they were found to be capable of detecting E. acervulina, E. maxima, E. praecox, and E. tenella oocysts isolated directly from poultry litter.     

棕熊蛔虫ITS rDNA的PCR扩增与序列分析

目的以核糖体DNA（rDNA）的第一与第二内转录间隔区序列（ITS-1及ITS-2）鉴定从广州动物园棕熊分离的蛔虫种类。方法应用PCR方法以保守引物NC5和NC2扩增蛔虫样本的ITS及5．8SrDNA序列,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEsay载体,用菌落PCR及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落进行测序,并与Gen．Bank“公布的人蛔虫（Ascaris lumbricoides）、猪蛔虫（Ascariis suum）、浣熊贝利斯蛔虫（Baylisascaris procyonh）及狮弓蛔虫（Toxascaris leonina）ITS序列比较。结果从棕熊分离的2个蛔虫样本的ITS及5．8SrDNA总长为859—861bp,种内相似性为99．7％,与GenBank^TM公布的人蛔虫、猪蛔虫、浣熊贝利斯蛔虫及狮弓蛔虫的相似性分别为84．6％、84．5％、89．3％及72．3％,序列差异明显。结论棕熊蛔虫不同于上述种类蛔虫,可能为Baylisacaris transfuga.     

小耳花猪蛔虫ITS及5.8S rDNA序列扩增与分析

以分离自小耳花猪消化道内的蛔虫为研究对象,提取虫体的DNA片断,然后用引物对核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区ITS-1、ITS-2及5.8S序列进行PCR扩增。结果显示,目的片段ITS总长为1441 bp,2个不同样品之间的I TS序列没有差异。通过BLAST检索,与相关蛔虫I TS序列进行比较,发现与拜林蛔线虫(Bayl i sascari s t ransfuga)、猪蛔虫(Ascari s suum)和人蛔虫(Ascari s l umbri coi des)的ITS序列相似性分别为88%、98%和86%,与其他蛔虫的相似性均小于90%。     

Sequence and Phylogenetic Analysis of rDNA ITS of Three Eimeria Species in Rabbit

In order to study whether the internal transcribed spacers (ITS) sequence could be used as a molecular marker for the species identification of rabbit coccidian, the rDNA ITS of Eimeria intestinalis, Eimeria flavescens and Eimeria magna were amplified by polymerase chain reaction (PCR), and were cloned into pGEM-T Easy vector subsequently. The positive recombinant plasmids were identified by PCR and then sequenced. By sequence comparison and comparative analysis with the relative sequences of rabbit Eimeria spp. available in GenBank, the results showed that the lengths of Eimeria intestinalis, Eimeria flavescens and Eimeria magna were 1065, 1009 and 1047 bp, respectively, and the sequence homologies with the same species sequences were 99.2%, 99.0% and 94.5%, respectively, while were 55.3% to 82.1% compared with corresponding sequences of other different species sequences. The phylogenetic analysis using software Mega 5.0 showed that all rabbit coccidia clustered together in a clade, which was divided into two sister lineages, corresponding to the presence or absence of oocyst residuum. The result demonstrated ITS could be used as a molecular marker for the species identification of rabbit coccidia.     

白来航鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.