秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

A型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体的构建

采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代.     

H5N1禽流感病毒HA基因的重组腺病毒表达载体的构建

采用PCR方法扩增出禽流感病毒HA基因,将其定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中构建pAdtrack-H5,之后将pAdtrack-H5与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-H5,将pAdeasyd-H5经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有HA基因的腺病毒pAd-H5。结果表明:含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-H5和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-H5经PCR、双酶切及核苷酸测序鉴定无误。包装成功的腺病毒pAd-H5经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

猪α干扰素重组腺病毒的构建与鉴定

猪的病毒性疾病种类多且危害大,因此研发具有广谱抗病毒作用的猪α干扰素制剂具有重大意义.为了研制重组猪干扰素类制剂防制猪病毒性传染病,构建了携带猪IFN-α基因的重组腺病毒.应用PCR方法从猪肝组织基因组中扩增得到猪IFN-α基因后,直接克隆入腺病毒载体穿梭质粒中,构建出腺病毒重组穿梭质粒pAd-CMV-IFN-α,经Pme Ⅰ线性化后转化BJ5183感受态细胞,获得同源重组腺病毒质粒,Pac Ⅰ酶切后回收,脂质体介导下转染AD-293细胞,PCR检测表明成功构建了携带猪IFN-α基因的复制缺陷性重组腺病毒.     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因腺病毒载体的构建及包装

【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的腺病毒。【方法】通过对PCI-neo-hTERT质粒的改造,依次构建出JMB293-hTERT、pAdTrack-hTERT载体,将pAdTrack-hTERT经PmeⅠ线性化后与pAdEasy-1载体共转化到 BJ5183 细菌中进行重组,经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-hTERT。将pAdEasy-hTERT PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK293人胚肾细胞,培养7 d后,收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液;反复扩增3次后,测定重组hTERT腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体pAdTrack-hTERT;②通过同源重组将外源目的基因hTERT整合到腺病毒骨架载体中,得到重组质粒pAdEasy-hTERT;③成功获得了滴度为6.73×10¹⁰ GFU/mL的高滴度腺病毒颗粒。【结论】含有hTERT基因的重组腺病毒颗粒包装成功,为后续哺乳动物原代细胞永生化研究奠定了基础。     

表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。     

两步化学转化法构建猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒质粒

为了利用化学转化法快速构建携带猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒质粒以便获得表达该基因的重组腺病毒,首先把骨架质粒pAdeasy-1通过化学法转化到氯化钙法制备的E.coli BJ5183感受态菌中,通过含氨苄青霉素的LB平板筛选出含骨架质粒的阳性菌BJ5183/p,再次用化学法把插入有猪圆环病毒2型ORF2基因的穿梭质粒rpShuttle-CMV-276经PmeⅠ酶切线性化后转化到BJ5183/p感受态细胞中进行同源重组,再在含卡那霉素的LB平板上培养,筛选出卡那霉素抗性菌进行质粒抽提纯化,酶切并电泳鉴定,获得重组阳性质粒rPAD-276.结果表明,运用2步化学转化法构建重组腺病毒质粒是一种简便、快捷且容易操作的方法.     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因真核表达载体的构建与表达

为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究

将化学合成的人溶菌酶基因htYZ（444bp）构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L^-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL^-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,井探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定

[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。     

Bt基因介导的大豆抗蚜虫表达载体的构建

[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。     

甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因正反义表达载体的构建

为了改善甜瓜果实的品质及研究甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的生物学功能,本试验分别构建了甜瓜果实SPS基因的正义及反义表达载体。用PCR方法将克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用带有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增,然后将该扩增片段克隆到pMD19-T Simple载体上,再用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切,得到该基因编码区3.37 kb的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/XbaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的正义表达载体。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用KpnⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区830 bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的反义表达载体。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区（coding sequence,CDS）序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并在293A细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒,GFP标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞,实时荧光定量法（qRT-PCR）检测干扰效率。【结果】筛选出靶向牛SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了pAd-1053和阴性对照pAd-NC重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053和Ad-NC高滴度病毒,测定得到的病毒滴度分别为7×108 GFU•mL-1和9×108 GFU•mL-1。Ad-1053和Ad-NC分别侵染牛前体脂肪细胞,qRT-PCR检测结果显示Ad-1053可显著降低SREBP1基因的mRNA 水平（干扰率＞85%）,而Ad-NC对SREBP1基因表达无明显影响。【结论】成功筛选得到靶向干扰牛SREBP1基因的有效shRNA,并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。