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NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应(overlapping PCR)法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆(golden gate)方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。 相似文献
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促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号参与调控植物的多种逆境、生长发育以及花青苷的合成通路。为探究SlMAPK6在番茄中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计3个靶标位点定点编辑SlMAPK6,并获得突变体CRISPR-3和CRISPR-7。PCR和测序结果发现SlMAPK6敲除载体构建成功。通过对T1植株进行卡那霉素基因筛选、靶位点扩增测序及行脱靶效应分析,结果发现矮番茄植株成功突变且未脱靶,与野生型对照表型相比,所有突变植株表现出根系更发达、侧枝增多的表型,表明SlMAPK6在番茄植株形态建成的过程中发挥了重要作用,为进一步探究SlMAPK6在番茄生长发育中的作用奠定了基础。 相似文献
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由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)组成的系统被发现广泛存在于细菌及古菌中,是机体长期进化形成的由RNA指导的降解外源遗传物质的适应性免疫系统。由于该系统可以识别靶向序列完成DNA的双链切割,因此从2013年起,CRISPR/Cas9系统即被改造为基因编辑工具。作为一种新型的基因组编辑技术,CRISPR/Cas9系统具有设计简单、特异性强、效率高等优点,为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命,并且迅速在基础理论、转基因动物生产、基因诊断和临床治疗等领域中得到广泛的研究与应用。然而,CRISPR/Cas9也存在着脱靶效应和外源基因插入困难等一些亟待解决的问题,这在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。因此,近年来围绕CRISPR系统改进获得了一系列可用于基因编辑与基因表达修饰的新工具。本文介绍了CRISPR系统的组成、工作原理,并综述了近几年来基于CRISPR系统开发的几种新型基因编辑工具以及基因表达修饰工具的研究进展和应用,并对其应用前景和发展方向进行了展望。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
CRISPR/Cas9系统是新一代的基因定点编辑技术,已成功应用于多种物种,例如,人、鼠、果蝇等。简单介绍该技术在水稻中的研究进展。涉及该系统的启动子、转化方法、突变效率等内容。 相似文献
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MAP65-3是植物胞质分裂的重要调节因子。为探究水稻OsMAP65-3基因的功能,本研究采用CRISPR/Cas9技术对水稻中OsMAP65-3基因(OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2)进行编辑。针对每个基因各设计了2个不同的靶位点,并将OsMAP65-3.1与OsMAP65-3.2的靶位点放在同一个载体上,构建了CSMAP65-3A和CSMAP65-3B 2个双基因编辑载体。通过农杆菌介导的遗传转化分别获得17和21个植株,PCR鉴定阳性植株分别为16和20株。对T0代植株靶位点附近序列进行测序分析,结果表明OsMAP65-3s基因均被成功编辑,OsMAP65-3.1 2个位点编辑效率为17.50%和9.38%,OsMAP65-3.2 编辑效率为15.62%和45.00%;T0代已获得osmap65-3.2、osmap65-3.2/OsMAP65-3.1(+/-)和OsMAP65-3.2(+/-)/OsMAP65-3.1(+/-)材料。本研究为进一步创制OsMAP65-3s突变体,开展基因功能研究和水稻胞质分裂分子机制解析奠定了理论基础。 相似文献
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CRISPR/Cas9是由小导向RNA介导的基因组定向编辑技术。自2005年以来,该技术得到飞速发展,在生物学、医学和作物遗传育种等多个学科得到广泛应用。与以往的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)及类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9技术具有独特的优越性,以其简便的操作和极高的编辑效率成为目前最主要的基因编辑技术。本文系统阐述了CRISPR/Cas9技术的起源发展、基因编辑特点,总结了该技术在作物基因编辑和其他方面的应用,旨在为利用该技术进行农作物种质创新、基因挖掘和育种提供参考。 相似文献
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利用CRISPR/Cas9创造早熟香味水稻 总被引:2,自引:0,他引:2
《土壤与作物》2017,(2)
黑龙江省是我国最大的水稻种植区,近年来水稻种植面积不断增加,为加快高纬度、低积温的地区品种选育进程,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对第二积温带主栽品种绥粳14的抽穗期基因Hd2、香味基因Badh2进行编辑。通过T_1代的分子鉴定,Hd2和Badh2基因被敲除而且基因型纯合。田间鉴定表明,转基因抗性标记也被成功剔除的两个株系,绥粳14-d1和绥粳14-d2,比绥粳14提早13天左右。利用咀嚼法、氢氧化钾浸泡法和气相色谱-质谱联用技术(GCMS)测定香味,结果显示绥粳14-d1和绥粳14-d2中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量显著高于绥粳14。综合以上结果,本研究利用基因编辑技术,成功获得了改良的抽穗期缩短香米品种,为早熟、优质水稻品种的选育提供了理论指导,加速了育种进程。 相似文献
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从水稻材料H9808航天诱变的后代中筛选出1株与色素相关的突变体,该突变植株在幼穗分化期新出幼叶的叶脉为橙红色,到拔节后期植株节间及下部约1/3的茎秆均呈现橙红色,在茎杆节底部中心有一橙红色的原点,抽穗时颖壳为橙红色,并保持到种子成熟,遗传分析表明突变体受1对隐性基因控制。在突变体与9311杂交的F2代隐性群体中,利用SSR标记将橙红色基因定位在2号染色体RM5350和RM12601标记之间,遗传距离分别为0.55cM和1.38cM。再利用新设计的InDel标记,进一步将该基因定位在S1和S2之间,遗传距离分别为0.41和0.25,为克隆水稻橙红色基因奠定了基础。 相似文献
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为建立一套可操作性强、广谱性强、高效的基因编辑辣椒遗传转化体系,以辣椒B2为试验材料,磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)和载体质粒pCas9-TPC按质量比1:1复合30 min后,加入混有辣椒花粉的培养基中,于MagnetoFACTOR plate24磁板下室温放置30 min,在磁场作用下导入花粉。将携带CRISPR/Cas9基因载体的花粉进行人工授粉,果实成熟后收获种子。通过载体质粒DNA上携带的抗除草剂(草铵膦)抗性标记,检测转化情况。提取T0代植株的DNA和RNA及T2代DNA,以pCas9-TPC为模板设计引物进行PCR扩增,检测T0和T2代植株中是否存在pCas9-TPC载体,对T0代植株进行Southern杂交检测基因编辑载体与辣椒基因组的整合情况。结果显示,平均转化效率约为63.70%,PCR检测显示T0代植株DNA和RNA及T2代DNA均扩增出CRISPR/Cas9载体,随机选取8株阳性植株进行Southern杂交,随机出现1~3条条带。本研究表明纳米磁性颗粒介导的花粉转化法可以在辣椒上建立高效的基因编辑转化体系,为辣椒的遗传育种提供更好的工具。 相似文献
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利用CRISPR/Cas9系统高效敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区 总被引:1,自引:0,他引:1
斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列.本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统,敲除预测的Nondret002679基因启动子区以沉默Nondret0026 79基因的表达,研究IncRNA基因Nondret0026 79在斑马鱼中的调控功能.首先利用启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、gR2、gR3、gR4、gR5和gR6.人工合成gRNA转录模板,体外转录为gRNA,与Cas9 mRNA一起显微注射到斑马鱼卵中.PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39%.繁殖启动子区敲除的杂合鱼,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾缺失是在两条同源染色体上.该初步研究表明,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lncRNA基因的启动子区,并且这种敲除可以遗传至下一代,为研究lncRNA功能提供了一个有效的基因编辑工具. 相似文献
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多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
在转基因动物的研究中,一般采用随机插入的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合,严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传,是转基因动物研究亟待解决的问题。转基因定点整合技术,即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径,但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术,并构建了用于鳜鱼的体内多位点基因打靶的打靶载体,本文开展多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究。以鳜鱼rDNA基因(编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含干扰素基因的打靶载体,以其间隔序列为靶位点,针对鱼类胚胎发育特点,采用精子介导技术进行多位点基因打靶,最终获得定点整合干扰素基因的鳜鱼,并建立一套适用于动物的基因定点敲入的体内基因打靶技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法,获得鳜鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞,采用脂质体介导法使多位点基因打靶载体在鳜鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法,利用筛选药物G418和GCV(更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后,对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证明了干扰素基因在鳜鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的多位点基因打靶载体在鳜鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理,利用筛选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗,结果成功孵化出106尾转基因鳜鱼鱼苗。(4)培育6个月后,取20尾转基因鳜鱼进行鉴定。采用PCR、RT-PCR、测序等方法进行定点整合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转入的基因——干扰素基因,其中有3尾实现了定点整合并表达。本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中,建立一套适用于鱼类的高效、安全的多位点基因打靶技术,并获得外源基因定点整合并表达的鳜鱼。 相似文献
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一个水稻脆性突变体的遗传分析与基因定位 总被引:1,自引:3,他引:1
化学诱变处理籼稻品种E532,M3代中筛选出茎、叶均较脆的突变体,定名fr(fragile rice)。遗传分析表明,该脆性突变体受两对隐性基因叠加控制。以fr突变体与粳稻02428杂交的F2代群体为基因定位群体,利用SSR分子标记将fr突变位点分别定位在1号染色体上的SSR标记RM302和RM212外侧,遗传距离分别为11.89cm和15.19cm;7号染色体在RM11和RM234之间,遗传距离分别为9.36cm和10.01cm。这些结果为进一步研究脆性突变体及其基因精细定位打下基础。 相似文献
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为进一步明确外源基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传稳定性及目标性状表现,本研究以转双价抗菌肽基因(ShivaA-cecropinB)纽荷尔脐橙(Citrus Sinensis Osbeck)无性繁殖后代植株为材料,通过PCR扩增,Southern杂交和实时定量PCR检测,以及温室抗病性评价分析等,对抗菌肽ShivaA基因在转基因柑橘后代株系中的遗传稳定性进行了研究.结果表明,外源抗菌肽Shiva A基因在转基因及其无性后代中能够稳定整合与表达.Southern杂交分析表明,ShivaA基因在无性繁殖后代基因组中为1个拷贝,而在T0代中为2个拷贝,由此推测T0代植株为混合嵌合体.定量PCR分析表明,ShivaA基因在To代中的表达水平低于其无性繁殖后代.本研究中外源基因的表达与拷贝数的多少成负相关.研究结果为开展转基因柑橘安全性评价提供了有用的实验材料,积累了有效的实验数据. 相似文献