CRISPR/Cas9定点编辑水稻LOC_Os05g31750基因位点及靶修饰位点遗传稳定性研究

为明确CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的持续剪切是否会导致原已突变的靶位点在水稻代际之间传递时再次产生新的突变,本研究以水稻粳稻品种台北309为转基因受体材料,通过CRISPR/Cas9技术定点编辑了水稻基因位点LOC_Os05g31750,并获得了6株靶位点敲除成功的T_0转基因突变体植株,经三代种植收获后,进一步对携带Cas9基因的T_1和T_2群体进行靶修饰位点PCR扩增测序检测。结果表明,来源于2个T_0纯合双等位突变体T_0-8和T_0-12的所有测试后代群体的靶修饰位点序列都与对应的T_0突变体保持一致,进一步证明CRISPR/Cas9基因编辑水稻的靶修饰位点在代际之间可以稳定遗传。本研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑突变体的遗传后代进行基因功能丧失后的表型分析提供了参考依据。     

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用综述

综述了CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用。在水稻基因组水平上进行基因定向编辑改造对水稻育种具有重要意义。CRISPR/Cas9基因编辑系统是近几年来研究发现的一种定点基因组编辑新工具,仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变,因其简便高效而被广泛应用于包括水稻在内的多种生物的基因组编辑中。     

CRISPR/Cas9系统在水稻分子育种中的应用

CRISPR/Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,其操作方便、效率高、成本低。水稻作为全球粮食安全的战略作物,优质高产的水稻培育尤为重要,CRISPR/Cas9技术为水稻分子育种带来了突破。本文回顾了基因编辑技术的发展,详细介绍了CRISPR/Cas9系统的结构、组成及原理,重点阐述了该技术在水稻分子育种中的应用,探讨CRISPR/Cas9系统存在的问题以及其在分子育种的发展前景。     

硝酸还原酶基因启动子NRE2元件缺失对烟草氮代谢的影响

为了探究硝酸还原酶基因启动子中硝酸盐响应元件NRE2缺失对烟草植株氮代谢的影响,以烤烟品种K326为材料,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了烟草NIA11和NIA2基因启动子中NRE2元件缺失的突变体材料,并于同一氮素营养条件下培养,测定烟草植株氮代谢相关生理指标.结果表明,与野生型相比,单突变体和双突变体叶...     

CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突变体的构建、鉴定及分析

NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆（golden gate）方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。     

CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是新一代的基因定点编辑技术,已成功应用于多种物种,例如,人、鼠、果蝇等。简单介绍该技术在水稻中的研究进展。涉及该系统的启动子、转化方法、突变效率等内容。     

利用等位基因特异性PCR技术检测番茄高色素基因hp1和hp2的SNP

摘要：番茄高色素基因hp1和hp2突变体与野生型基因相比均发生了单碱基的点突变,常规PCR技术很难把它们区分开。本试验对碱基错配类型和位置与特异性PCR的关系进行了研究。结果表明：引入TA-TG双碱基错配的引物,退火温度在49.3+0.1℃时能把hp1基因的突变位点和野生型的对应位点区分开来。引入T-C碱基错配的引物,退火温度在53.5+0.1℃时能把hp2基因的突变位点和野生型的对应位点区分开来。错配碱基在引物3′端的位置对PCR的特异性影响不大。     

过量表达盐芥TsIPK2基因增强转基因水稻耐盐性

【目的】本试验以野生型(WT)和转盐芥TsIPK2基因的水稻为材料,研究NaCl胁迫条件下过量表达TsIPK2基因对水稻植株抗盐胁迫能力的影响。【方法】取水稻材料种子和其3叶龄幼苗,分别在不同NaCl浓度(0、50、100、150、200 mmol/L)下进行处理。检测WT与过量表达TsIPK2基因水稻种子的发芽率、主根长和芽长、幼苗的丙二醛(MDA)和脯氨酸的含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,以及与胁迫相关的5个基因的表达。【结果】在盐胁迫下,与野生型相比,转基因水稻具有更好的发芽率、主根长和芽长。野生型和转基因水稻两者的脯氨酸含量增加,转基因水稻的积累量显著高于野生型,但是转基因水稻MDA含量增加幅度小于野生型。野生型和转基因水稻幼苗SOD酶活性均增加,但转基因植株的酶活性显著高于野生型;二者POD酶活性呈现先升高后下降的趋势,但是二者活性没有显著的差别;转基因水稻的CAT活性也呈现先升高后下降的趋势,然而野生型水稻的CAT活性在盐胁迫下没有显著的变化。高盐处理后,野生型和转基因水稻的5个与胁迫相关的基因表达倍数都增加,与野生型相比,转基因水稻的OsP5CS1、OsSOD、OsCATB和OsLEA3的表达量显著升高,而OsPOX1基因的表达量变化不显著。【结论】过量表达TsIPK2基因能够通过增强水稻的渗透调节能力、抗氧化胁迫能力并调节胁迫相关基因的表达,以提高水稻的耐盐性。     

水稻多胚基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

为构建水稻多胚基因OsPE的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以OsU6a启动子为模板,通过两轮Overlapping PCR构建出一个sgRNA的表达盒。在T_4连接酶的作用下,将sgRNA表达盒连接到酶切后的CRISPR/Cas9编辑载体中。先进行菌液PCR验证和酶切验证,后通过测序检测,获得一套多胚基因的pYLCRISPR/Cas9-gRNA载体,为多胚基因的进一步研究提供新的路径。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在作物中的应用

CRISPR/Cas9是由小导向RNA介导的基因组定向编辑技术。自2005年以来,该技术得到飞速发展,在生物学、医学和作物遗传育种等多个学科得到广泛应用。与以往的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)及类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9技术具有独特的优越性,以其简便的操作和极高的编辑效率成为目前最主要的基因编辑技术。本文系统阐述了CRISPR/Cas9技术的起源发展、基因编辑特点,总结了该技术在作物基因编辑和其他方面的应用,旨在为利用该技术进行农作物种质创新、基因挖掘和育种提供参考。     

CRISPR/Cas9介导的番茄SlMAPK6突变对植株形态的影响

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号参与调控植物的多种逆境、生长发育以及花青苷的合成通路。为探究SlMAPK6在番茄中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计3个靶标位点定点编辑SlMAPK6,并获得突变体CRISPR-3和CRISPR-7。PCR和测序结果发现SlMAPK6敲除载体构建成功。通过对T₁植株进行卡那霉素基因筛选、靶位点扩增测序及行脱靶效应分析,结果发现矮番茄植株成功突变且未脱靶,与野生型对照表型相比,所有突变植株表现出根系更发达、侧枝增多的表型,表明SlMAPK6在番茄植株形态建成的过程中发挥了重要作用,为进一步探究SlMAPK6在番茄生长发育中的作用奠定了基础。     

纳米磁性颗粒介导的辣椒遗传转化体系建立

为建立一套可操作性强、广谱性强、高效的基因编辑辣椒遗传转化体系,以辣椒B2为试验材料,磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)和载体质粒pCas9-TPC按质量比1:1复合30 min后,加入混有辣椒花粉的培养基中,于MagnetoFACTOR plate24磁板下室温放置30 min,在磁场作用下导入花粉。将携带CRISPR/Cas9基因载体的花粉进行人工授粉,果实成熟后收获种子。通过载体质粒DNA上携带的抗除草剂(草铵膦)抗性标记,检测转化情况。提取T₀代植株的DNA和RNA及T₂代DNA,以pCas9-TPC为模板设计引物进行PCR扩增,检测T₀和T₂代植株中是否存在pCas9-TPC载体,对T₀代植株进行Southern杂交检测基因编辑载体与辣椒基因组的整合情况。结果显示,平均转化效率约为63.70%,PCR检测显示T₀代植株DNA和RNA及T₂代DNA均扩增出CRISPR/Cas9载体,随机选取8株阳性植株进行Southern杂交,随机出现1~3条条带。本研究表明纳米磁性颗粒介导的花粉转化法可以在辣椒上建立高效的基因编辑转化体系,为辣椒的遗传育种提供更好的工具。     

一个水稻黄绿叶突变体ygl15的鉴定和基因定位

由籼稻品系杂交后代中发现1个黄绿叶突变体,命名为ygl15。为揭示突变体ygl15叶色变异机制,对其进行了表型鉴定和基因定位分析。结果表明,突变体ygl15从苗期开始表现为黄绿叶,叶片中的叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型显著下降,并最终导致其农艺性状受到影响,表现为株高、有效穗数、单株总粒数和单株实粒数显著下降,穗长、每穗粒数和结实率的变化不显著,千粒重略有提高;基因表达分析表明,突变体ygl15叶片中,叶绿素合成和光合系统相关的基因表达上调,但血红素合成相关的基因表达下调或不变。遗传分析表明,ygl15的突变表型受1对细胞核隐性基因控制。以突变体ygl15和中花11杂交的F_2群体为定位群体,经过初步定位和精细定位,将ygl15基因定位在水稻第3号染色体上的分子标记M08124～M08175之间,物理距离约79 kb。本研究结果为进一步克隆ygl15突变基因和研究基因功能奠定了一定的理论基础。     

磷胁迫下蔗糖对水稻苗期根适应性和磷酸转运蛋白基因表达的影响

磷是植物生长和发育中最重要的必须元素之一。尽管土壤中磷资源很丰富,但大部分磷是以植物不能吸收利用的固定态和有机态存在,特别是以酸性土壤为主的南方稻田,水稻缺磷现象非常严重。理解和掌握水稻对低磷的适应机制有助于利用分子手段培育磷高效利用水稻品种。为阐明蔗糖提高水稻耐低磷的机制,本研究对水稻幼苗进行不同磷、糖处理,分析水稻幼苗在不同磷糖配比培养基中的根系结构、无机磷、酸性磷酸酶活性的变化,并利用定量RT-PCR技术分析水稻磷酸转运蛋白基因(OsPT)和酸性磷酸酶基因(OsSAP1)的表达。试验设2个磷浓度:无磷和85 mg·L?1KH2PO4,2个蔗糖浓度:无糖和3%蔗糖,正交设计。结果表明,在低磷胁迫时添加蔗糖,能使水稻幼苗的根总长度、总根数、根冠比显著增加,根分泌的酸性磷酸酶活性降低,但水稻体内的磷酸转运酶活性提高。11个与磷具有高度亲和力的磷酸转运酶的表达发生了改变,其中根优势表达的4个基因OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT6对磷、糖的影响最为敏感,暗示了蔗糖是通过调节磷转运蛋白维持磷的吸收和平衡。增加根系的蔗糖分配能够提高水稻幼苗对磷胁迫的耐受性。     

水稻脆秆矮生突变体鉴定及基因定位研究

经过氮离子束处理的籼稻品种9311,其M₂代中发现1株茎、叶均较脆且株高偏矮的突变体,暂定名为矮脆(dfr)。该突变体株高74.5cm,而野生型株高为122.9cm;细胞壁成分分析表明,突变体和野生型叶片纤维素含量分别为13.8%和23.8%;半纤维素分别为24.2%和20.6%;突变体和野生型茎秆的纤维素含量分别为22.3%和34.1%;半纤维素分别为30.3%和18.6%;细胞壁其他成分无明显变化。遗传分析表明,该突变体脆性矮生性状受单隐性基因控制;以突变体dfr与02428杂交组合的F₂代群体为基因定位群体,利用SSR分析标记将dfr突变位点定位在2号染色体,位于SSR分子标记的RM5472和RM240之间,遗传距离分别为1.1cM和1.6cM。这些结果为研究脆秆矮生突变体及其基因克隆打下基础。     

基于CRISPR/Cas9技术对水稻细胞质分裂关键基因OsMAP65-3s的编辑

MAP65-3是植物胞质分裂的重要调节因子。为探究水稻OsMAP65-3基因的功能,本研究采用CRISPR/Cas9技术对水稻中OsMAP65-3基因(OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2)进行编辑。针对每个基因各设计了2个不同的靶位点,并将OsMAP65-3.1与OsMAP65-3.2的靶位点放在同一个载体上,构建了CSMAP65-3A和CSMAP65-3B 2个双基因编辑载体。通过农杆菌介导的遗传转化分别获得17和21个植株,PCR鉴定阳性植株分别为16和20株。对T₀代植株靶位点附近序列进行测序分析,结果表明OsMAP65-3s基因均被成功编辑,OsMAP65-3.1 2个位点编辑效率为17.50%和9.38%,OsMAP65-3.2 编辑效率为15.62%和45.00%;T₀代已获得osmap65-3.2、osmap65-3.2/OsMAP65-3.1(+/-)和OsMAP65-3.2(+/-)/OsMAP65-3.1(+/-)材料。本研究为进一步创制OsMAP65-3s突变体,开展基因功能研究和水稻胞质分裂分子机制解析奠定了理论基础。