CD31可作为分离纯化猪肝窦内皮细胞的标记分子

血小板-内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)是内皮细胞表面一种重要的膜分子,常作为特异性标记鉴定内皮细胞.然而,CD31是否可作为纯化猪(Sus scrofa)肝窦内皮细胞(porcine liver sinusoidal endothelial cell,pLSEC)的特异性标记还有待验证.本实验通过CD31流式分选分离纯化pLSEC,观察分离后的pLSEC是否具有标志性的窗孔结构.以α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的五指山小型猪为研究材料,采用胶原酶原位肝脏灌注、离体消化,Percoll梯度离心,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-CD31标记pLSEC进行流式分选.结果表明,分离得到的pLSEC在倒置显微镜下细胞呈典型的内皮细胞形态,铺路石样排列;通过透射电镜观察到细胞具有窗孔结构,通过环境扫描电镜观察到pLSEC与猪主动脉内皮细胞(porcine arterial endothelial cell,pAEC)细胞表面结构具有明显区别,pLSEC具有特殊的窗孔结构.利用实时荧光定量PCR检测pLSEC、pAEC和猪耳成纤维细胞(porcine ear fibroblast cell,pEFC)的CD31、细胞粘附因子(cell adhesion molecules,CD146)、血友病因子Ⅷ基因(hemophilia factorⅧ,Ⅷ-F)、血管性血友病因子基因(von willebrand factor,vWF)的表达.结果表明,pLSEC的CD31、CD146、Ⅷ-F和vWF表达量显著高于pAEC和pEFC.利用免疫荧光法检测到pLSEC具有摄取细胞膜红色荧光探针(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)标记的乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein,Ac-LDL)的内吞功能.总之,利用CD31分离纯化的pLSEC,具有典型窗孔结构和内吞功能,同时高表达CD146、Ⅷ-F和vWF等肝窦内皮细胞的标记分子,为进一步研究异种肝移植的血小板减少症的问题提供了良好的细胞材料.     

CRISPR/Cas9介导CMAH基因敲除猪创制及繁育分析

N-羟乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Gc)是引起异种移植排斥反应的重要非半乳糖抗原,由单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)催化生成。本研究以α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除猪为基础,利用CRISPR/Cas9制备CMAH基因敲除(CMAH~(-/-))巴马小型猪(Sus scrofa),并评估其健康及繁育状况。针对猪CMAH基因设计单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)并进行效率验证,敲除效率较高的CMAH-g1电转染巴马猪耳成纤维细胞(ear fibroblasts of Bama mini pigs,BMEF),鉴定为阳性的细胞作为核供体,利用体细胞核移植技术制备CMAH~(-/-)猪。提取仔猪基因组DNA,PCR测序确定突变类型;用Anti-Neu5Gc抗体进行免疫荧光检测确定仔猪器官Neu5Gc表达情况。采集4月龄CMAH~(-/-)巴马猪血液检测其生理指标;CMAH~(-/-)巴马公猪6月龄性成熟后配种,以母猪的产仔数评价CMAH~(-/-)公猪的繁育能力。结果成功获得CMAH~(-/-)巴马猪,有-2 bp/-2 bp和-1 bp/-1 bp共2种纯合敲除类型。免疫荧光检测结果显示在CMAH~(-/-)猪器官表面未检到Neu5Gc表达,表明CMAH基因被敲除。与野生型(wild type,WT)相比,CMAH~(-/-)猪血常规和血生化无显著差异,与CMAH~(-/-)公猪配种的母猪产仔数正常。本研究利用CRISPR/Cas9技术制备了GGTA1/CMAH基因敲除猪,健康状况和繁育能力正常,该猪可为进一步降低异种器官移植急性排斥反应提供低免疫原性供体。     

葡萄农残检测技术研究进展

葡萄是四大水果之一,具有很高的营养价值和经济价值。但是葡萄农药残留对人体健康的危害已日益引起广泛关注。本文主要阐述了利用分光光度法、气相色谱法、酶生物传感器法等技术对采后葡萄农药残留检测的研究进展。综述发现,分光光度法操作简单,耗时间短,但精确度较低,适用于定性研究;气相或液相色谱法是现阶段农药残留分析中的主要检测方法,精确度高,适用于定量研究;酶生物传感器以操作快速、简单,易于微型化等优势成为农药残留在线监测领域的研究热点。总之,葡萄农残检测技术正朝着简单、快速、便利、准确、高效的方向发展。     

八种食用菌提取物对不同类型肝细胞损伤保护作用

探究刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、瓦尼桑黄(Sanghuangporous vaninii)、灰树花(Grifola frondosa)、赤芝(Ganoderma lucidum)、香菇(Lentinula edodes)、蟹味菇[Hypsizygus marmoreus (brown cultivar)]、白玉菇[H. marmoreus (white cultivar)]的子实体和樟芝(Antrodia cinnamomea)菌丝体水提物及醇提物对乙醇、H₂O₂和对乙酰氨基酚诱导肝细胞损伤的保护作用。研究结果表明：在乙醇诱导的肝损伤中,相较于乙醇组,质量浓度为25、50、100μg·mL^-1的灰树花和樟芝醇提物和质量浓度为25、100、400μg·mL^-1的蟹味菇、刺芹侧耳、灰树花、香菇、白玉菇水提物均可显著提高肝细胞存活率。在H₂O₂诱导的肝损伤中,相较于H₂O₂组,质量浓度为25、50、...