肌肉生成抑制素和抑制素融合表达质粒的构建和表达

以乙肝表面抗原S基因为载体,分别将肌肉生成抑制素N端基因片段和抑制素N端基因片段分别插入S基因C端和第112～113 氨基酸残基密码子之间,构建MSTN-INH融合表达质粒pVAX-SMI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pVAX-SMI构建成功。脂质体法将pVAX-SMI转染HeLa细胞,Western Blot检测表达产物的免疫原性。结果表明,融合目的蛋白成功在HeLa细胞中表达,并具有免疫原性。     

串联抑制素基因克隆与重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。     

串联抑制素基因免疫对绵羊生殖的影响

利用基因免疫技术,以成功构建的串联抑制素重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3为免疫原,对60只绵羊(Ovis aries)进行基因免疫试验;应用酶联免疫法(ELISA)检测抗抑制素抗体;放射免疫法(RIA)测定处理后不同时期血清中激素水平.结果表明,重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊后,各实验组P(血样吸光值)/N(对照吸光值)值均显著高于对照组(P<0.05),且在第3次加强免疫后抗体水平明显上升.首次免疫后,促卵泡素(FSH)平均含量均高于对照组,且在第2次、第3次加强免疫阶段差异显著(P<0.05).第2次免疫后促黄体素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P)含量均高于对照组(P>0.05),第3次加强免疫后E2和P含量均显著高于对照组(P<0.05).两种重组质粒免疫绵羊后,双羔率分别为22.2%和30.0%,均与对照组差异显著(P<0.05).结果提示,串联抑制素基因免疫绵羊可促进FSH分泌,分子佐剂sC3d能增加绵羊对串联抑制素基因免疫的反应性,进而影响绵羊卵泡发育和诱导绵羊产双羔.     

生长抑素基因疫苗质粒pcS/2SS的构建、表达及免疫*

为构建高免疫原性的生长抑素（somatostatin，SS）DNA疫苗，将SS基因插入到pcS／SS中乙肝表面抗原（HBsAg）S基因第112-113氨基酸残基密码子之间，构建含2拷贝SS的融合表达质粒pcS／2SS。酶切和测序鉴定表明，重组质粒pcS／2SS构建成功。脂质体包裹法将pcS／2SS转染HeLa细胞，ELISA检测表达产物的SS免疫反应原性。结果表明，融合目的基因在HeLa细胞获得表达，S／2SS融合蛋白具有比S／SS融合蛋白更强的SS抗原抗体反应性。将pcS／2SS免疫6只大鼠后，2／3的大鼠产生了抗SS抗体，结果证明，所构建的质粒pcS／2SS可以表达生长抑素，表达产物具有免疫原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） BJ-4株ORF2基因的原核表达

通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF2扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF2(deleting ORF2)。将dORF2克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21细胞中成功地表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白GST-dORF2，表达量为22％。Westem-blot结果表明重组蛋白可被谷胱甘肽S-转移酶(GST)抗体识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV次要结构蛋白的结构和功能奠定了基础。     

猪肌肉生长抑制素(MSTN)前肽定点突变载体的构建及其原核表达

肌肉生长抑制素(MSTN)能够限制肌纤维的增粗增大,而突变的肌肉生长抑制素前肽(Pro-MSTN-D75A)能阻止MSTN与相应受体的结合,从而解除MSTN对肌纤维的抑制作用。猪是我国最重要的肉用家畜,通过操作MSTN提高其瘦肉产量,将对我国生猪生产具有特殊意义。本研究用通城猪妊娠3个月的胚胎为材料,提取背最长肌RNA并以此为模板,用反转录PCR扩增猪MSTN前肽cDNA序列(不含信号肽),并将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上。通过定点突变将编码天冬氨酸的密码子变为丙氨酸密码子(D75A),构建了原核表达载体pGEX-ProM(SP-)和pGEX-ProM(SP-)D75A。重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞并经IPTG诱导表达,结果表明,转化pGEX-ProM(SP-)质粒的E.coliBL21工程菌用终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导5h表达情况最好;而转化pGEX-ProM(SP-)D75A的工程菌在1mmol/L的IPTG诱导6h的条件下表达情况最好。用GST-Trap蛋白纯化系统纯化回收总分子量大小约为51kD融合蛋白(GST蛋白标签分子量为26kD,MSTN前肽蛋白分子量为25kD)。纯化蛋白的浓度ProM(-SP)为1.87mg/mL,ProM(-SP)D75A为1.21mg/mL。本研究建立了大肠杆菌表达猪MSTN前肽的最佳条件,提高了生产效率,并为研究MSTN前肽在动物体内的生物学功能以及制备单克隆抗体提供基础资料。     

表达猪源链球菌类M-MRP融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

利用PCR技术,分别扩增马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)ATCC35246株类Mszp基因583￣1063位碱基和猪链球菌(S.suis)2型HA9801株mrp基因298￣827位碱基的片段。通过在类M基因片段的3!端和mrp基因片段的5!端引物添加共同的SacⅠ酶切位点,利用T4连接酶连接,克隆至pET-32a( )载体。将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21,经IPTG诱导,可获得分子量约为60kD的融合蛋白。通过MRP和类M蛋白的多克隆抗体进行ELISA反应和免疫印迹分析表明:表达的融合蛋白同时具有类M蛋白和MRP的抗原性。用组氨酸亲和层析柱纯化的重组融合蛋白,和链球菌的全菌二联灭活疫苗分别免疫两组仔猪,重组蛋白的免疫保护率达60"。     

猪细小病毒VLPs供外源蛋白插入的候选位点发现及其重组PCV2-ORF2的病毒样颗粒构建

先将猪细小病毒(PPV)SC-1株VP2基因扩增产物克隆到pMD18-T载体构建质粒pMD-VP2;设计两对引物(分别引入Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个酶切位点)扩增猪圆环病毒二型(PCV2)SC株ORF2基因,构建了pMD-ORF2.A和pMD-ORF2.B两质粒;经相应内切酶酶切后回收目的片段,插入PPV SC-1株VP2基因的Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个特异限制酶切位点处(分别对应于PPV VP2蛋白N端和C端1/3处),得到重组质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B.经鉴定后的质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和ApaL Ⅰ三酶切,回收含VP2和ORF2基因的目的片段克隆至真核表达载体(pEGFP-C1),得到重组质粒pEGFP.VO.A和pEGFP.VO.B.脂质体法转染重组质粒于Cos7细胞后,采用荧光显微镜和电镜观察基因表达情况,结果仅在转染pEGFP.VO.A的样品中观察到了病毒样颗粒(VLPs).纯化VLPs免疫小鼠,结果显不能产生较好的细胞免疫和针对PPV和PCV2的特异性体液免疫,该结果表明研究中获得了PCV VP1-PCV2ORF2重组VLPs,同时也揭示PPV VPLs的N端1/3适于外源蛋白插入构建重组VLPs     

传染性胃肠炎病毒(TGEV)双启动子真核表达载体pVAXD-N/S的构建与鉴定

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的高度接触性传染病.TGEV的S、N基因具有重要的免疫学功能,构建S、N双基因疫苗将能提供更好的免疫效果.本研究用RT-PCR扩增S基因抗原区(2.1 kb,含A、B、C和D完整的抗原位点)和N基因编码区(1.2 kb),分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点(MCS),构建了单价质粒pVAXD-N和pVAXD-S,然后将N基因插入pVAXD-S中,构建了双启动子真核表达质粒pVAXD-N/S.将pVAXD-N/S与对照组(pVAXD-N、pVAXD-S和pVAXD)转染COS-7细胞进行表达鉴定,用RT-PCR可从pVAXD-N/S转染细胞中扩增出s、N两个目的基因,IFA鉴定结果显示,pvAXD-N/S可同时表达S、N两种目的蛋白.初步的小鼠(Mus musculus)免疫试验结果显示,pVAXD-N/S免疫小鼠后第14天即可检测到抗TGEV的IgG抗体,第35天抗体达最高峰,pVAXD-N/S诱导的抗体水平显著高于单基因质粒组pVAXD-N和pVAXD-S的抗体水平(P＞0.5),与混合质粒(pVAXD-N+pVAXD-S)诱导的抗体水平相当.本研究结果表明,构建的双启动子表达载体pV AXD-N/S具有S、N基因的双重免疫功能,为TGEV新型双基因疫苗研究提供了基础材料.     

牛杀菌/通透性增加蛋白氮端片段的原核表达

目的 克隆牛杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达BPI蛋白,并纯化重组蛋白。方法 参照Genbank报道的序列,应用RT-PCR技术,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白基因,然后将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。结果 获得BPI N端长度为714 bp的基因片断,序列分析证实该片断中有1个点突变。大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量约为52×103的GST-BPI融合蛋白。结论 成功的表达和纯化了BPI重组蛋白。     

河道堤防滩地的水土流失及其防治

平原地区河道堤防滩地的水土流失,直接淤积河床,影响行洪安全。堤防滩地的水土流失是自然因素和人为因素共同作用的结果,以新修堤防的水土流失最为严重,对其防治须实行工程措施、植物措施和人为预防相结合。     

论水土、水土生态与水土生态保持

在论述水土在陆地生态系统中的地位和作用的基础上,提出了水土生态的概念,认为植被与水土不可分割的整体观念是水土生态的重要特征。同时,对水土生态保持的含义作了新的定义,并将水土生态保持划分为四大类型,即生态型、自然型、生产型、建设型。从水土生态的高度,从源头上、要素的联系中去认识和防治水土流失,是一种主动的、有机的、整体的水土保持观念,是水土保持认识观的深化和发展,将使水土生态保持事业进入一个崭新的时代。     

Charge characteristics and exchangeable cation status of Korean Ultisols and Alfisols and Thai Ultisols and Oxisols

The charge characteristics of A₁ or Ap and B₂ horizon samples of total 23 Ultisols, Alfisols and Oxisols in Korea and Thailand were studied by measuring the retention of NH₄⁺ and NO₃^? at different pH values (4–8) and NH₄NO₃ concentrations (0.1–0.005 m ). The magnitude of their negative charge (σ^?; meq/100g) was dependent on pH and NH₄NO₃ concentration (C; m ) as represented by a regression equation: log σ^?=apH +blogC +c. The values of the coefficient a (0.04–0.226), b (0.03–0.264) and c (–0.676–1.262) were correlated with the kinds of the soil and horizon and with the region where the soil exists. The retention of NO₃^? was less than 1 and 2–3 meq/100 g for the A₁ or Ap and B₂ horizon samples, respectively. The sum of exchangeable base and Al (‘effective’ CEC) was close to and higher than the magnitude of permanent charge (=σ^? measured at pH = 4.3 and at C = 0.005 m ) for one-third and two-thirds of samples, respectively. A σ^? value of 16 meq/100 g clay at pH = 7 and C = 0.01 m was found appropriate to separate the B₂ horizons of Thai Ultisols and Oxisols from those of Korean Ultisols and Alfisols. Korean Alfisols and Ultisols and Thai Ultisols were distinguished from each other on the status of exchangeable base and Al     

水土保持监督管理程序与时效图文解析

水土保持法律规范和相关行政法律规范,共同构成了水土保持监督管理法律体系,其内容庞杂,相互交叉、融合,程序复杂。通过一组网络图及其简要注释,直观地表述了水土保持监督管理工作的相关程序、时效、逻辑关系和法律依据;通过对网络图呈现的逻辑问题所反映出的法律缺陷进行分析,提出应当按照立法法的有关规定,对现行法律特别是水土保持法律法规进行必要的修改,以适应不断发展的水土保持监督管理工作需要的建议。     

防治水土流失 建设巴渝秀美山川

重庆地处长江上游、三峡库区,由于三峡库区水土流失严重、生态环境脆弱、自然灾害频繁,且三峡库区的水土保持和生态建设事关全市经济社会发展全局、事关三峡工程建成后的安全运行和库区的长治久安,因此是我市水土保持生态建设的重点。虽然,“长治”工程的有效实施,使我市的水土保持生态建设取得了较大的成绩,但离全面建设小康社会的要求尚有不少的差距,因此,我们要紧紧抓住国家实施可持续发展战略和西部大开发战略的历史机遇,进一步增强紧迫感、责任感和使命感,调动全社会各界力量,防治水土流失,改善生态环境,建设巴渝秀美山川。     

我国滑坡、崩塌的区域特征、成因分析及其防御

论述了我国滑坡、崩塌的区域分布特征,滑坡和崩塌的危害程度,滑坡和崩塌类型和成因分析,并且提出了灾害的防御措施,以期达到环境保护成为社会发展过程中的一个重要组成部分。     

Study on Soil and Pine-Seedling Zn and Mn and Predicting-Model Design

Soils were collected from 2-year (2-y) and 3-year (3-y) old red-pine seedling plots in two tree nurseries, Hayward in the north and Wilson in the southwestern part of Wisconsin State respectively, and equilibrated with 0.01 M Ca(NO₃)₂ for soil solution Zn and Mn (solu-Zn and Mn), and with 0.01 M Ca(NO₃)2+0.005 M EDTA for soil adsorbed Zn and Mn (ad-Zn and Mn). Buffering capacity of soil Zn and Mn (b-Zn and Mn) was obtained from the ratio of ad-Zn and Mn to the solu-Zn and Mn. The concerned traces in pine seedling needles (ndls), stems(sts) and roots (rts) were simultaneously measured.     

城镇开发区建设中的人为水土流失及防治措施

简析了婺源县城镇开发区建设过程中造成水土流失的状况、危害、原因后,提出了其防治措施,并阐明开展城市（镇）水土保持的紧迫性。     

Sodium and potassium effects on cation concentration and yield of lucerne and phalaris grown separately and together

Abstract

Lucerne (Medicago sativa L.) and phalaris (Phalaris aquatica L.) were grown separately and together in a pot trial on a yellow‐brown pumice soil with three rates of sodium (Na) and two rates of potassium (K) in factorial combination. Lucerne alone had a low Na concentration but growing phalaris as a companion grass produced herbage with a Na concentration adequate for stock. Na application increased the Na concentration in phalaris and the mixture of phalaris and lucerne much more than in lucerne alone; had little effect on K concentration; slightly reduced Mg concentration; and greatly reduced Ca concentration but not as much in lucerne as in phalaris or the mixture with lucerne. K application increased K concentration and reduced Na, Ca and Mg concentrations throughout. Yield of phalaris grown alone and in combination with lucerne was increased significantly by Na application when K concentration in the plants was low. Yield of lucerne was not affected by Na application and it is concluded that Na did not substitute for K in this species. It is concluded that field trials are warranted to investigate the possibility of growing a special purpose mixture of lucerne and phalaris on New Zealand yellow‐brown pumice soils to provide feed that has adequate Na for grazing animals.