花生籽仁黄酮含量遗传模式分析

黄酮是花生种子中重要的功能性成份,明确花生籽仁黄酮含量的遗传模式,为培育高黄酮花生品种奠定基础。本研究以花育22号和P76为亲本构建的重组自交系群体为材料,鉴定其种子黄酮含量,结果表明,亲本花育22号及P76的黄酮含量分别为19μg RTE/g FW、70μg RTE/g FW,群体花生种子黄酮含量在4~181μg RTE/g FW之间。采用植物数量性状分离分析软件分析其遗传模式,结果表明花生种子黄酮含量受四对主基因控制,主基因遗传力为98.48%,具有加性效应,加性效应值在-46.7535~234.6343之间,基因之间具有互作效应,三对基因间的互作可提高花生籽仁黄酮含量。     

发根农杆菌介导的茶树发根高频诱导与遗传转化

以两种野生型发根农杆菌菌株、三种共培养培养基和六种外植体为试材,建立了茶树发根高频诱导体系,最高发根诱导频率达30%以上。最佳发根诱导体系为：OD₆₀₀为0.5~0.8的发根农杆菌菌液侵染已培养60~70βd苗龄无菌苗茎段10~50βmin,在添加100βmmol/L乙酰丁香酮的YMB固体培养基上共培养2βd,在含500βmg/L头胞噻肟钠的MS培养基上诱导发根。发根在不含激素的LG₀培养基上生长迅速,产生大量侧枝和根毛。PCR证实,发根农杆菌Ri质粒T-DNA的rolA、rolB和rolC基因已经插入到发根基因组DNA中。应用此发根诱导体系,以含携带Bt基因的双元载体质粒pCAMBIA2301的发根农杆菌15834,侵染茶树外植体诱导出发根,PCR和GUS组织化学染色证实外源基因已经插入到基因组DNA中并获得表达。     

发根农杆菌介导抗菌肽Shival基因转化马铃薯的初步研究

利用已构建载体530 Shiva,转化马铃薯普通栽培种甘农薯1号、澳布、HLS和夏波蒂的试管苗及块茎盘的研究.结果表明,以Kan 50 mg·L-1和100 mg·L-1作为筛选转基因细胞和植株的剂量.对于发根农杆菌侵染马铃薯试管苗应采用新鲜菌落直接涂抹伤口进行侵染,这种方法诱导生根率高且易于操作,根诱导率、成愈率及分化率远高于浸泡法;发根农杆菌转化试管苗,后期愈伤组织分化产生5个幼苗.发根农杆菌菌液侵染甘农薯1号和夏波蒂两品种的块茎盘,7 d后就有很小的毛状根突起产生,2周后即有大量毛状根产生,3周后毛状根产生量有所减少,产生的毛状根3周时其成愈率分别为31.0%和27.0%,愈伤组织分化成苗比较困难,分化出3个幼苗,分化率分别为6.45%和3.70%.转化材料进行冠瘿碱检测表明,分化苗均为胭脂碱阳性反应.环腐病菌接种试管苗结果表明,分化植株与对照相比抗性明显增强.     

发根农杆菌介导抗菌肽Shiva1基因转化马铃薯的初步研究

利用已构建载体530Shiva,转化马铃薯普通栽培种甘农薯1号、澳布、HLS和夏波蒂的试管苗及块茎盘的研究。结果表明,以Kan50mg·L-1和100mg·L-1作为筛选转基因细胞和植株的剂量。对于发根农杆菌侵染马铃薯试管苗应采用新鲜菌落直接涂抹伤口进行侵染,这种方法诱导生根率高且易于操作,根诱导率、成愈率及分化率远高于浸泡法;发根农杆菌转化试管苗,后期愈伤组织分化产生5个幼苗。发根农杆菌菌液侵染甘农薯1号和夏波蒂两品种的块茎盘,7d后就有很小的毛状根突起产生,2周后即有大量毛状根产生,3周后毛状根产生量有所减少,产生的毛状根3周时其成愈率分别为31.0%和27.0%,愈伤组织分化成苗比较困难,分化出3个幼苗,分化率分别为6.45%和3.70%。转化材料进行冠瘿碱检测表明,分化苗均为胭脂碱阳性反应。环腐病菌接种试管苗结果表明,分化植株与对照相比抗性明显增强。     

农杆菌介导的花生遗传转化条件优化

为建立花生快速高效的遗传转化体系,以浸泡吸水后的花生半粒种子为转化受体,利用根癌农杆菌介导法,以除草剂Basta抗性筛选及基因组DNA的Bar基因PCR检测为指标,优化花生遗传转化体系。研究结果表明,在侵染悬浮液中加入1mmol/L二硫苏糖醇（DTT）提高了农杆菌介导的转化效率（最高提升36.5 %）;与YEB培养液相比,AB重悬液的使用显著提高了农杆菌的转化效率（最高提升19.3 %）;农杆菌菌液OD600为0.7时转化效率最高;基因型显著影响转化效率,EXP27-1516的转化效率为69.03%,显著高于14AU01（56.67 %）;以花生半粒种子为转化受体,从种子培养到形成茁壮根系仅需8周,明显短于子叶节转化所需的13周。优化后的农杆菌介导的花生遗传转化体系为花生转基因研究提供了重要的研究工具。     

茶叶儿茶素对发根农杆菌的抑制作用及抗酚菌株筛选研究

本文研究了茶叶儿茶素对发根农杆菌的抑制作用并进行了抗酚菌株的筛选。结果表明：儿茶素（TC80）对发根农杆菌有明显的抑制作用,其MIC90为25~100 μg/ml,这阐明了茶树中富含儿茶素等多酚类是制约农杆菌介导法对茶树进行遗传转化的关键因子。通过抗酚筛选获得的抗酚菌株R1000AP,其抗酚性提高10~40倍,其诱导茶树的发根频率提高46.5%（P<0.05）。     

苦参毛状根的诱导培养及氧化苦参碱含量的测定

本文主要利用三种发根农杆菌A4、15834、R1601诱导苦参产生毛状根,初步为建立苦参的毛状根培养体系提供参考。本实验采用共培养法,考察了不同外植体、菌种、培养时间对苦参毛状根诱导率的影响,并对苦参毛状根中氧化苦参碱进行初步的含量测定。研究结果表明,苦参毛状根的最佳诱导条件是以生长1周的苦参幼芽为外植体,R1601为菌株,添加100μmol/l的乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃暗处诱导,最终测定诱导率最高为27.6%,存活率为45.8%,而苦参毛状根中氧化苦参碱的富集量为1.68mg/g(苦参毛状根干重),未检测到苦参碱。     

茶多酚对农杆菌介导的植物遗传转化体系的影响

为研究在农杆菌介导的茶树遗传体系中,茶多酚对农杆菌侵染效率的影响,以LBA4404、EHA105、ATCC15834和K599 4个农杆菌菌株为研究对象,分析其在不同浓度茶多酚处理下的耐酚能力、被膜完整率、吸附性、vir和chv基因表达,以及遗传转化差异。结果显示,4个菌株的耐酚能力依次为LBA4404>K599>EHA105>ATCC15834,其中EHA105和ATCC15834菌株对茶多酚较为敏感;ATCC15834菌株被膜完整率与茶多酚的浓度、静置时间呈负相关,EHA105在600 mg·L^-1茶多酚处理48 h后,其被膜完整率最低;ATCC15834和EHA105对烟草叶肉细胞的吸附能力随着茶多酚浓度的升高而降低,在经茶多酚处理24 h后,ATCC15834中chvB和EHA105中chvB2的表达受到显著抑制,virA表达量与低浓度酚类的敏感性呈正相关性;烟草经农杆菌菌液（含茶多酚）侵染后,瞬时转化效率和稳定转化效率均受到不同程度的抑制,发状根诱导率大大降低。1 000 mg·L^-1茶多酚处理后,ATCC15834的发根诱导率最低,仅为13.85%,坏死率高达33.85%。综上所述,茶多酚会降低农杆菌活力和被膜完整率,chv基因通过降低表达量影响其吸附性,最终导致烟草转化体系中瞬时转化效率和稳定转化效率均受到不同程度的抑制。     

根癌农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化影响因素研究

为建立和优化根癌农杆菌介导的大麦遗传转化体系,以大麦幼胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化大麦的主要影响因素。结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织诱导率为转化指标,筛选出了对大麦幼胚感染力比较强的农杆菌菌株EHA105,以及高敏感受体基因型甘啤4号和秀81-47等。实验结果还表明,预培养1 d的大麦幼胚具有较高的瞬时表达率(91%),是较好的转化受体。菌液侵染浓度OD600=0.5,侵染时间为30 min时转化效率最高。在此基础上,侵染后幼胚与农杆菌采用液体共培养方式可明显提高转化效率,gus基因瞬时表达率最高可达90%。在优化条件下,转化约30 d后抗选择剂潮霉素(Hyg)的愈伤组织占受体组织总数的34.2%。     

农杆菌介导的小麦幼胚遗传转化体系的优化

为了优化农杆菌介导的小麦幼胚转化体系,通过对4个小麦品种河农827、石新828、河农825、良星99的幼胚组织培养及再生系统的研究表明,在改良培养基MSW1和MSW2中,小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率与MSW0培养基相比分别提高了6.0%和5.4%,并且显著提高了植株再生能力。采用混合正交试验设计,对农杆菌遗传转化过程中小麦幼胚的诱导培养基、诱导时间、农杆菌侵染浓度、侵染时间进行了优化。结果表明,在诱导培养基MSW2,诱导培养6d,OD660=1,侵染时间3h时,愈伤GUS瞬时表达率及抗性愈伤成活率最高,对河农827成活的抗性再生植株进行PCR检测,获得了候选转基因植株。     

发根农杆菌转化茶树细胞的应用前景

本文介绍了发根农杆菌转化茶树的机制、感染方法以及影响遗传转化的因素,并阐述了毛状根在茶树生产中的应用现状及前景。     

根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。     

二穗短柄草成熟胚再生体系建立及农杆菌介导转化研究

为建立二穗短柄草组织培养及遗传转化体系,以二穗短柄草BD21-3成熟胚为外植体,对成熟胚愈伤诱导、分化以及农杆菌侵染条件进行了研究。结果表明,在含有2.5mg·L~(-1) 2,4-D的培养基上,愈伤组织出愈率最高为93.83%;在含有0.2mg·L~(-1) KT的分化培养基上,分化率最高为38.18%;对二穗短柄草胚性愈伤组织农杆菌转化和GUS染色结果表明,侵染的过程中农杆菌菌液浓度OD_(600)为0.6、侵染时间为5min时转化率最高。     

根癌农杆菌介导花生高效遗传转化体系的优化

本文研究表面活性剂(MES,methyl ester sulfonate)、真空渗入法和二次侵染对提高花生转化效率的影响,建立了一种农杆菌介导的花生快速高效遗传转化体系。该体系以带子叶的胚轴为外植体,在OD600为0.7的菌液中,加入150mg/L的MES,40kPa真空处理10min,共培养3d后进行二次侵染。采用该体系可显著提高遗传转化率,GUS基因阳性表达率最高,达73.3%。     

负压和超声波处理对农杆菌介导的花生遗传转化效率的影响

为了提高根癌农杆菌介导的花生遗传转化效率,研究了不同强度的负压和超声波处理时间对外植体芽诱导率的影响以及对花生遗传转化的作用.结果表明,较低强度(抽拉30次)的负压处理和短时间(2min)的超声波处理对花生遗传转化有促进作用,虽然超声波处理延长了芽再生时间,但是有助于提高花生外植体芽点诱导率.     

茶树发根中茶氨酸和儿茶素类含量的分析

茶树发根在LG₀培养基和添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基上生长迅速,但只在一个培养于LG₀培养基的发根克隆中检测到高含量的茶氨酸,含量达到23.12βmg/g鲜重,高于未转化根的18.77βmg/g鲜重。除茶氨酸外,该发根克隆中也检测到高含量的天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸。发根克隆培养于添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基,茶氨酸的含量则显著降低,说明培养基组成也是影响发根中茶氨酸的含量的因素之一。茶树发根中也含有少量的儿茶素类单体,主要为儿茶素和表儿茶素。     

农杆菌介导的花生遗传转化研究

对影响花生遗传转化效率的PPT筛选压、根癌农杆菌的侵染浓度、侵染及共培养时间等因素进行研究，采用农杆菌转化花生叶片，成功地将抗虫基因豇豆蛋白酶抑制基因(CpTI)和耐除草剂基因(Bar)导入花生。实验结果表明，外植体在MS 3mg／LBA 0．8mg／LNAA 2mg／LAgNO3 6mg／L Gln培养基上预培养3d，于OD600为0．3的农杆菌菌液中浸泡5～7min后培养2d，再转移至含有3mg／LBA 0．8mg／LNAA 2mg／LAgNO3 6mg／L Gln 500mg／LCb 300mg／LCef 0．25mg／LPPT的MS培养基诱导筛选培养，3个月后得到24个再生株系。经PCR初步检测，有7个株系显示了310bp的CpTI基因核酸片段，Southern杂交证实了5个株系有外源基因的整合。     

农杆菌介导的籼稻9311和华占遗传转化体系的研究

【目的】水稻转基因技术是推动水稻分子生物学研究和精准育种的重要工具。农杆菌介导法是水稻遗传转化的主流方法。然而受基因型限制,典型籼稻的转化效率仍然偏低,需提高其转化效率。【方法】以顽拗型籼稻品种9311和华占为受体材料,研究了不同大量元素、微量元素、有机物和碳源的组合,植物激素浓度,侵染培养基,乙酰丁香酮（AS）浓度和光周期对遗传转化效率的影响。【结果】在成熟种子组织培养试验中,MS大量元素、B5微量元素、N6有机物和麦芽糖为9311最优组合,华占最优组合为MS大量元素、MS微量元素、MS有机物和麦芽糖。诱导培养基中添加0.5mg/L的BAP或1.5mg/L的KT可显著提高9311和华占的组织培养再生率,可达70.0%以上。在侵染过程中,添加100μmol/LAS的转化效率高于200μmol/LAS。光周期实验显示9311和华占宜采用不同的光周期策略,9311在全黑暗条件下进行愈伤诱导和筛选,在全光照条件下进行分化,转化效率最高,达6.0%～6.4%,而华占在12h光照/12h黑暗条件下进行诱导、筛选和分化,获得的转化效率最高（5.0%～7.5%）。【结论】本研究优化了顽拗型籼稻931...     

花生子叶遗传转化再生体系影响因素的研究

本试验选用子叶为外植体研究了影响植株再生和遗传转化的因素。结果表明,细胞分裂素(6-BA)5.00 mg/L (2,4-D)1.50 mg/L的诱导培养基子叶外植体丛生芽诱导率最高,分别达89.67%和83.33%。遗传转化影响因素结果表明,菌液OD600为0.5-0.7、侵染时间10min、共培养时间3d、每50mL菌液添加烟草提取物1.0mL可获得较好的转化效果。抗生素对芽分化率影响的研究结果表明,当头孢唑林钠(Cef)250 mg/L 羧苄青霉素(Carb)250-500 mg/L时效果最好,不但可以完全抑制农杆菌生长,而且有较高的芽诱导率。     

花生种子白藜露醇的诱导 与抗黄曲霉侵染关系的研究

通过比较抗—感花生品种受黄曲霉菌侵染后,种子诱导白藜露醇的差异,探讨白藜露醇诱导与花生种子 抗黄曲霉侵染关系。结果表明:受黄曲霉侵染后,花生种子白藜露醇诱导的速度与抗性有关。抗性品种在受侵染 后3d种子内的白藜露醇大量累积并达到峰值,含量提高30倍;而感病品种则在受侵染后4d才达到此峰值。放线 菌素酮和放线菌素D处理后接种试验表明,种子本身含有合成白藜露醇的mRNA,当受外源黄曲霉菌侵染时能激 活与合成白藜露醇相关酶的活性,合成大量白藜露醇。