Bacillus subtilis 168菌株产surfactin改造

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株基因组中含有编码surfactin合成酶系的srfA操纵子,却不产抗菌肽surfactin。运用同源重组的方法将外源的有活性的sfp基因(编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)整合入B.subtilis 168中,将其改造为产surfactin的菌株。通过分析多株枯草芽孢杆菌和解淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的sfp基因,从基因的上、下游找出较为保守的区域,设计引物,从枯草芽孢杆菌Nja-9中扩增sfp基因,将获得的sfp基因与P43启动子和终止子相连,构建了sfp基因表达框,并连接于枯草整合质粒pDG1730上,最终构建了枯草芽孢杆菌整合质粒pST-1730,利用pST-1730本身的淀粉酶E基因与B.subtilis 168菌株的基因组DNA进行同源重组整合,获得了产surfactin的重组菌株B.subtilis121。本研究为surfactin合成酶基因的改造和分析奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)是纳豆发酵产氨的关键酶.本文以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板,根据枯草芽孢杆菌的GDH编码基因(RocG)序列设计引物,进行PCR扩增,再经pMD19-T质粒TA克隆,获得了全长为1275 bp、与RocG基因同源性为98%的纳豆芽孢杆菌GDH的编码基因.构建原核表达载体pET28a-GDH,转化至E.coli BL21(DE3)进行体外诱导表达.表达的包涵体在超声破菌、变性、纯化和复性后,经SDS-PAGE分析得到了47 kDa的特异条带.纳豆芽孢杆菌GDH同时具有NAD+和NADP+依赖活性,酶活分别为6.7723 U·mg-1蛋白和9.4205 U·mg-1蛋白.     

一株鹿源纤维素降解菌Lu14的分离与鉴定

从梅花鹿粪便中分离筛选出24株芽孢杆菌,初筛获得10株具有纤维素降解能力的菌株,经过复筛,菌株Lu14纤维素降解能力较高,其内切葡聚糖酶活和滤纸酶活分别为1.106 U/m L和0.76 U/m L。对Lu14进行菌落形态、生理生化特征鉴定和16S rDNA序列分析,结果发现其与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性高达99.99%,故鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。     

一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌NWMCC0137全基因组测序及分析

NWMCC0137是从屠宰场下水道污泥中分离获得的1株高效分解血液蛋白并具有良好生物防控特性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。为探究枯草芽孢杆菌NWMCC0137(B.subtilis NWMCC0137)高效水解血液蛋白机制及挖掘次级代谢产物编码基因资源，利用DNBSEQ与PacBio测序平台对其进行全基因组测序并进行序列组装和基因预测、功能注释、比较基因组分析。结果表明B.subtilis NWMCC0137的基因组长度为4 215 585 bp, G+C含量为44.23%;编码基因总长度为3 711 885 bp,编码4 384个基因，编码序列占整个基因组长度的88.05%,非编码RNA中包含85个tRNA基因。在KEGG数据库中B.subtilis NWMCC0137基因组被注释到7种胞外蛋白酶编码基因，其中与丝氨酸蛋白酶相关的编码基因有8个。通过antiSMASH预测发现，菌株NWMCC0137基因组中包含7种与已知次生代谢产物合成基因簇相似度为100%的基因簇，包括产孢致死因子、聚酮类化合物、丰原素、枯草芽孢杆菌素168、儿茶酚型嗜铁素、芽孢杆菌素、杆菌...     

无花果内生真菌的抑菌活性筛选

以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）为测试菌种,对无花果根、茎、叶中分离出的87株内生真菌进行活菌筛选,结果表明：无花果87株内生真菌中有36株对1种或多种指示菌有拮抗作用,其中对金黄色葡萄球菌有抑菌作用的有18株,对枯草芽孢杆菌有抑菌作用的有11株,对大肠杆菌有抑菌作用的有7株;活性菌株抗菌活性多以中等活性为主,高活性和低活性的菌株较少。从36株有活性的菌株中选出具有代表性的20株内生真菌的代谢产物进行抗菌活性筛选,结果表明20株菌株的代谢产物至少对1种供试菌株具有抑菌活性。     

枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专利菌株.为探明其高效的蔗糖代谢机制,用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖-6-磷酸水解酶基因(XFsacA基因),其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97%的相似性,且发生了12个氨基酸突变.将该基因中约1.4 kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上,构建了重组表达质粒pQE30-XFsacA,该质粒转入到不能利用蔗糖的Escherichia coli BL21中,后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长,并表达出了一条约54 000蛋白条带.结果预示XFsacA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础,同时XFsacA基因的克隆与其在E.coli中的表达研究,为利用蔗糖发酵的工程E.coli构建奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌分泌载体构建及其对脂肪酶A的分泌表达

[目的]构建含不同信号肽编码序列的枯草芽孢杆菌分泌表达载体,并研究这些载体对脂肪酶A的分泌表达效率。[方法]克隆得到枯草芽孢杆菌168株的脂肪酶A编码基因,同时扩增得到蛋白质NprE、Bpr、YweA的信号肽编码序列,构建了脂肪酶A分泌表达载体pMA5-estA、pMA5-nprE-estA、pMA5-bpr-estA和pMA5-yweA-estA,并转化到枯草芽孢杆菌168株中得到相应的重组分泌表达菌株。[结果]对4株重组表达菌株进行摇瓶培养,所有菌株都实现了脂肪酶A的分泌,20 h后,168（pMA5-bpr-estA）的细胞外脂肪酶A的酶活力达到1.68 U/ml,约占该菌株脂肪酶A总表达量的86%。[结论]枯草芽孢杆菌Bpr信号肽对脂肪酶A具有较高的分泌效率。     

枯草芽孢杆菌amy-3基因突变是sacQ基因失活造成的证据

amy-3是枯草芽孢杆菌的一个基因突变类型,它造成产淀粉酶的表型丧失。本实验初步证明,克隆的 sacQ 基因转入 amy-3枯草芽孢杆菌菌株 SO113后,可以恢复其淀粉酶活性。表明这个突变没有使淀粉酶结构基因发生改变,突变可能发生在调控基因。     

绿色荧光蛋白基因标记枯草芽孢杆菌研究

将源于枯草芽孢杆菌168的木糖启动子xylR和来源于载体pGFPuv的gfp基因连接,插入枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pIM,成功构建了以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组载体pIM-GFP.转化枯草芽孢杆菌菌株BS523,突变株在荧光显微镜及紫外灯下均观察到较强的绿色荧光,同时PCR鉴定结果正确.表明重组载体pIM-GFP成功转入菌株BS523,并且gfp基因成功表达.     

灌水下限对基质栽培番茄生长、水分利用效率及果实品质的影响

在日光温室基质栽培条件下,以‘欧盾’番茄为试验材料,田间持水量的90%为灌水上限,研究了40%、50%、60%、70%、80%灌水下限对越冬茬番茄生长、产量、水分利用效率及果实品质的影响.结果表明:随着灌水下限的提高,茎粗、叶片数、干物质积累量、单果质量、水分利用效率及根冠比均表现出先增大后减小的趋势,其峰值均出现在60%～70%灌水下限处,且显著大于灌水下限40%、50%处理.灌水下限80%处理的叶片数、地下部干鲜质量及水分利用效率显著小于灌水下限60%、70%处理,且总灌水量及灌水次数大于其他处理.田间持水量的60%～70%为日光温室番茄基质栽培的理想灌水下限.     

地下滴灌灌水下限与灌水器流量对冬小麦生长发育的影响

为探明地下滴灌条件下灌水下限与灌水器流量对冬小麦生长的影响,采用3种灌水器流量(0.1、0.9和1.5 L/h)与2种灌水下限(试验地土壤田间持水量的80%和60%)的全因素试验,分析不同试验处理对土壤水分分布及冬小麦生长的影响。结果表明:试验处理下较高流量的地下滴灌灌溉水分下渗量较大,使得40～80 cm土层土壤含水率提高,较小流量的地下滴灌水分主要保存在上层土壤;灌水下限为80%田间持水量较60%田间持水量能够促进冬小麦株高、叶面积指数、干物质积累量和产量的增加,同时能够减缓灌浆期旗叶叶绿素含量的降低;不同灌水器流量处理以0.9 L/h处理冬小麦叶面积指数最高,提高灌水器流量能够减缓灌水下限为60%田间持水量处理下灌浆期旗叶叶绿素含量的降低。综合作物生长、产量及水分利用效率,本试验条件下最优灌溉制度为,灌水下限80%田间持水量,灌水器流量0.9 L/h。     

滴灌下限对日光温室葡萄生长、产量及根系分布的影响

【目的】 探究自动控制灌溉条件下灌水水平对葡萄生长发育与水分消耗的影响,为温室自动灌溉条件下葡萄水分管理提供决策依据。 【方法】 以3年生‘玫瑰香’为研究对象,利用CR1000数据采集器、土壤水分传感器和电磁阀联合自动控制灌水,设置8个不同的灌水下限（分别为田间持水率的50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%和85%）,灌水上限均为田间持水率的90%,研究不同灌水下限对温室葡萄地上部和地下部生物量、产量、水分利用等的影响。 【结果】 当灌水下限低于田间持水率的75%时,随着灌水下限的提高,新梢长度、新梢茎粗以及叶面积指数均显著增加,当灌水下限超过田间持水率的75%时,新梢的生长受到不同程度地抑制;葡萄根系在0-60 cm土层中均有分布,但主要分布在0-30 cm土层中,该层的根体积以及根系表面积分别占总根系的75%-89%、77%-83%。在葡萄根系分布最为集中的0-10 cm和10-20 cm土层中,各根系指标均随着灌水下限的提高呈先增加后减少的趋势,其中当灌水下限为田间持水率的75%时,各根系指标均最大。当灌水量低于6 000 m ³·hm ^-2时,各根系指标均随着灌水量的增加而增大,当灌水量达到7 000 m ³·hm ^-2时,各根系指标均出现下降或增长缓慢的趋势;当灌水下限是田间持水率的75%时,葡萄的产量和水分利用效率均为最高,分别达到32 270.31 kg·hm ^-2、4.85 kg·m ^-3。 【结论】 综合考虑葡萄新梢生长、根系分布、产量和水分利用等因素,滴灌条件下葡萄水分管理的最佳土壤水分区间为田间持水率的75%-90%,可以作为该种植模式下适宜的灌溉控制指标的推荐值。     

调亏灌溉对‘阳光玫瑰’葡萄产量品质和水分利用率的影响

为了探索杨凌地区最佳的‘阳光玫瑰’葡萄果实生长及品质的水分调控阈值。在‘阳光玫瑰’葡萄的花期、果实膨大期和着色成熟期分别设置轻（田间持水量65%的土壤含水量）、中（田间持水量55%的土壤含水量）两种干旱胁迫,以全生育期充分供水为对照,研究不同生育期调亏灌溉对‘阳光玫瑰’葡萄生理生长状态、果实产量、品质指标及水分利用率的影响。结果表明,与充分供水相比,花期中度干旱胁迫提高果实品质和产量,每667 m²产量增加5.52%,水分利用率提高8.58%;果实膨大期轻度干旱胁迫每667 m²产量减少4.42%;着色成熟期中度干旱胁迫显著提高果实品质,但每667 m²产量减少0.39%,水分利用率提高2.49%。综合生长指标、水分利用率、产量及品质指标四个方面得出花期中度水分胁迫最佳灌溉制度。     

酿酒葡萄膜下滴灌土壤水分分布规律的研究

[目的]研究膜下滴灌条件下不同灌溉定额对酿酒葡萄土壤水分的动态变化规律的影响.[方法]通过田间试验,以不覆膜为对照,研究覆膜条件下酿酒葡萄不同生育期土壤水分动态变化规律.[结果]覆膜能有效保证土壤水分不易散失.土壤水分大多集中在20～60 cm的深度.7～8月是葡萄生长发育旺盛和葡萄果实膨大、着色、成熟的关键时期.[结论]膜下滴灌是保证葡萄增产节水的重要措施.保持20 ～60 cm土层适宜的土壤含水量是葡萄生产的重要因素.7～8月应适时加大灌溉量并缩短灌水周期,满足葡萄生长的需要.     

调亏灌溉对酿酒葡萄生长及果实品质的影响

【目的】了解调亏灌溉（regulated deficit irrigation,RDI）技术对酿酒葡萄生长及果实品质的影响,为酿酒葡萄节水灌溉技术提供理论依据。【方法】在大田条件下,以葡萄（Vitis vinifera L.) 欧亚种酿酒品种赤霞珠(Cabernet Sauvignon）、品丽珠(Cabernet Franc）和黑比诺（Pinot Noir）为试材,以不同的灌水量进行调亏灌溉,对葡萄生长及果实品质进行比较分析。【结果】在RDI条件下,酿酒葡萄的副梢发生率、枝条生长量显著降低;随着调亏程度的加大其叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)和气孔导度(Gs)均呈下降趋势,但水分利用效率显著提高;调亏灌溉对葡萄果粒大小和产量无明显影响,但果实中可溶性固形物及还原糖含量增加,总酸含量降低,糖酸比升高;另外,轻度的调亏灌溉有利于葡萄皮中酚类物质含量的提高。【结论】调亏灌溉在节约用水的前提下,既有效抑制酿酒葡萄的营养生长,又提高了果实品质。     

土壤湿度对酿酒葡萄品质的影响

以香格里拉市七年生的酿酒葡萄赤霞珠(Vitis vinifera L.cv.Cabernet Sauvignon)为研究对象,分析比较了不同试验点土壤湿度对果实品质的影响。结果表明,茨中点在整个生育期内土壤湿度满足了葡萄的正常生长需求,相关果实品质符合正常酿造要求。尼通点的葡萄果实糖酸比过低,不适宜做酿造原料。达日点的土壤湿度偏低,其葡萄粒重等指标明显低于其他试验点,影响产量。阿东点的整个生育期内土壤湿度合理,在转色成熟期时维持较低的土壤水分,该试验点糖酸比最高,葡萄品质较好。而达日点的土壤湿度明显偏低,较为干旱,应进行适当灌溉。在香格里拉市葡萄种植区对葡萄进行节水调质灌溉时,可将阿东点的土壤湿度水平作为参考,在转色成熟期维持较低水平的土壤湿度既有利于提高水分利用效率,又有利于增加酿酒葡萄总糖的积累和保持适宜的总酸量。     

沿海围垦区普通塑料大棚内黄瓜需水量研究

[目的]开展沿海围垦区大棚内黄瓜(Cucumis ativus)需水量试验,对指导大棚内作物种植,发展精准灌溉具有重要的意义。[方法]以20 cm深处土壤含水率的上下限,确定土壤的灌水时间、灌水量。苗期土壤含水率的上下限分别按田间持水率70%～100%、80%～100%控制;开花坐果期、盛果期土壤含水率的上下限分别按田间持水率70%～100%、80%～100%、90%～100%控制。[结果]春、秋两季种植的黄瓜需水量在300 mm左右,秋黄瓜生育期需水量略高于春黄瓜。两者的需水量、需水强度均随着作物生长而增大,盛果期最大,春黄瓜盛果期需水量173.1 mm,需水强度5.09 mm/d;秋黄瓜盛果期需水量156.7 mm,需水强度4.09 mm/d。[结论]秋黄瓜与春黄瓜各生育期的需水强度及需水量差异较大,棚内温度差异是造成春、秋两茬黄瓜需水规律不一致的主要原因。     

施肥对贺兰山东麓滴灌条件下‘赤霞珠’葡萄产量和品质的影响

为探究不同施肥量对滴灌条件下酿酒葡萄产量和品质的影响,以6年生酿酒葡萄‘赤霞珠’为供试材料,在宁夏吴忠市红寺堡区开展田间试验。试验设置不施肥（0 kg·hm^-2,CK）、低肥（450 kg·hm^-2,F1）、中肥（840 kg·hm^-2,F2）和高肥（1 050 kg·hm^-2,F3）4个施肥水平,研究不同施肥量对酿酒葡萄生长发育、产量和品质的影响。结果表明,施肥能显著促进酿酒葡萄生长发育,提高光合特性、果实外观以及营养物质含量。F2处理显著促进了新梢生长。施肥能显著促进叶片叶绿素相对含量的增加,但对植被差异指数影响不显著。施肥能促进果实纵径的生长,但对果实横径生长影响不显著。各处理的果形指数处于0.94~1.12之间,施肥处理对葡萄果实颜色指数的影响均达到极显著水平。F2处理的果实产量最高,其可溶性固形物和可溶性糖含量也均最高,分别为23.16%和19.22%,F3处理的可滴定酸含量最高,为0.78%。各施肥处理中,糖酸比变化范围为26.54~31.73,F2处理最大,为31.73。酿酒葡萄的花色苷含量、总酚含量及Vc含量均随施肥量的增加表现为先增大后减小的趋势,均于F2处理达到最大,分别为1.26、69.22和8.65 mg·g^-1。可见,840 kg·hm-2施肥处理的葡萄植株生长、叶片光合效率和葡萄产量均最高,该施肥处理还可提高葡萄的含糖量和Vc含量,降低果实可滴定酸含量,有利于糖酸比的提高,葡萄品质最佳。研究结果可为葡萄生产提供科学和技术支持。     

不同灌溉上限对温室黄瓜初花期生长动态、产量及品质的影响

对不同栽培季节、不同土壤灌溉上限处理的温室黄瓜初花期的生长发育动态、产量、品质及水分利用效率进行了研究。结果表明,90%田间持水量灌溉上限处理较为理想,相比100%田间持水量灌溉上限处理而言,秋茬和春茬茎粗分别增加0.03和0.05cm,而根冠比差异不显著;根瓜节位分别降低1.39和0.69节;根瓜还原糖含量、可溶性总糖含量、Vc含量、可溶性蛋白质含量分别增加11.8g/kg,13.2g/kg,10.0mg/kg,0.13g/kg和10.3g/kg,4.5g/kg,24.9mg/kg,0.13g/kg;前期产量分别增加9.09%和7.77%;水分利用效率分别提高26.14%和22.72%。说明90%田间持水量为黄瓜初花期较适宜的节水灌溉上限指标。