1983～1989年美国活禽市场和养禽场分离到的禽流感H5N2毒株的序列分析

美国最近爆发的高致病力的禽流感是由H5N2高株引起的，该毒株曾引起1983-1984年美国宾西法尼亚洲和新泽西州禽流感的爆发，在1986-1989年间，从美国的养禽场和活禽市场分离到了多株H5N2毒株，通过对11个病毒株的血凝素的非结构基因完整的代码序列和血凝素亚单位蛋白1的序列检测，并将其和以前分离到的毒株序列进行比较。结果表明1986-1989年分离到的H5N2毒株和1983-1984年引发宾西法尼亚州禽流感的毒株具有高度同源性，研究进一步证实了禽流感长期存在和进化于美国的活禽市场，为活禽场与1983年宾西尼亚洲禽流感爆发的相关性提供了更多的依据。     

国外禽流感研究进展

禽流感病毒广泛分布于世界各地，是一种急性传染病，每一次暴发都给养禽业造成巨大的经济损失。1流行范围美国自1929年以来，仅鸡就先后有名次流感病暴发（1975年，阿拉巴马州，H4N8型；1978年，明尼苏达州，H6N1型；1983～1984年，宾夕法尼亚州，H5N2型；1985～1986年，纽约、新泽西州、马萨诸塞州和俄亥俄州，H5N5型），其中在阿拉巴马州和宾夕法尼亚州暴发的两次死亡率高。目前，美国从美洲鸵鸟和超鹊身上分离到禽流感病毒，Panigrahy和Serine列举了从这些鸟类分离到的病毒，其中1992年暴发的为H3N2型，1993年暴发的为H4N2型、H5N…     

鸭源H10亚型禽流感病毒血凝素基因的序列分析及其致病特性

采用血清学试验和RT-PCR方法从华东地区家养水禽中分离鉴定出多株H10亚型禽流感病毒，对其中1株A／Duck／Yangzhou／502／2003（简称Dk／YZ／502／03）的血凝素（HA）基因进行了序列测定，并与GenBank中登录的其他序列进行了比较。结果显示，Dk／YZ／502／03株血凝素基因与哺乳动物水貂分离株A／Mink／Sweden／84（H10N4）的同源性最高；其推导的氨基酸剪切位点序列为P-E-I-M-Q-G-R，为典型低致病性禽流感病毒的特征序列，这与该毒株对SPF鸡和BALB／c小鼠的低致病特性相吻合。     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒（AIV）在广西中越边境地区的流行情况，本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒，命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6），对其HA和NA基因进行序列测定，并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示，分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012（H1N2）的核苷酸同源性最高（96.9%），NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016（H5N6）的核苷酸同源性最高（98.2%）。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒分子特征；与部分N6亚型禽流感病毒一样，分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外，本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定，结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2，3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）是一株重组低致病性禽流感病毒。     

1株H1亚型水禽流感病毒分离株的致病特性和表面膜蛋白基因的序列分析

采用常规血清学试验和特异性RT-PCR方法,对我国华东地区家养水禽流感病毒进行了长达4年的跟踪监测,分离到多株H1亚型禽流感病毒,并对其中的1株A/Duck/Yangzhou/163/2003(简称Dk/YZ/163/03)的血凝素基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果发现,Dk/YZ/163/03的血凝素基因(HA)与禽流感日本分离株A/Japan/91(H1)的同源性最高;而神经氨酸酶基因(NA)与Mallard dk/A1b/35/1976(H1N1)同源性最高;其推导的氨基酸剪切位点序列为P-S-I-Q-S-R,是典型低致病性禽流感病毒的特征序列,这与该毒株对SPF鸡和BALB/c小鼠的低致病特性相吻合。     

鸭源H5N5亚型禽流感病毒HA和NA序列分析

<正>2010年从长春地区患病鸭体内分离得到1株病毒,应用胶体金检测技术、血清学试验、RT-PCR检测技术及BLAST比对分析,最终证实该病毒为H5N5亚型禽流感病毒。本试验利用Primer Premier 5.0引物设计软件,依据NCBI上禽流感病毒序列,设计血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因的引物,对分离病毒株的HA和NA基因进行克隆及序列分析,在     

H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜蛋白基因的序列测定和遗传进化分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行4年多的监测，分离鉴定出多株H4亚型禽流感病毒。对其中的A／Duck／Yangzhou／216／2002（简称Dk／YZ／216／02）、A／Duck／Yangzhou／526／2003（简称Dk／YZ／526／03）、A／Duck／Yangzhou／36／2004（简称Dk／YZ／36／04）的血凝素基因和Dk／YZ／526／03、Dk／YZ／36／04的神经氨酸酶基因进行了克隆测序，并与GenBank中收录的其它序列进行了比较，遗传进化结果表明Dk／YZ／216／02的血凝素基因（HA）与毒株Tk／Minnesota／833／80（H4N2）同源性最高，而Dk／YZ／526／03和Dk／YZ／36／04的血凝素基因（HA）均与Budgerigar／Hokkaido／1／77（H4N6）同源性最高；而神经氨酸酶基因（NA）遗传进化分析结果表明Dk／YZ／36／04（H4N6）的NA基因与毒株Pigeon／Nanchang／8-142／2000（H3N6）同源性最高，而Dk／YZ／526／03（H4N2）的NA基因与Dk／Hokkaido／13／00（H9N2）同源性最高，3株禽流感病毒的HA推导的氨基酸剪切位点序列均为P-E-K-A-S-R，为典型低致病性禽流感病毒的特征序列，与对SPF鸡的致病力试验相吻合。     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒的分离鉴定

在广东进行流行病学调查时从鹦鹉采集的拭子样本中分离到一株禽流感病毒,应用聚合酶链反应(PCR)、血凝抑制试验(HI)和基因测序等方法技术对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且被H5亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制;分别用针对禽流感病毒的M、H5亚型禽流感病毒的HA基因、N2亚型禽流感病毒的NA基因特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,均扩增出特异性目的片段;测序及BLAST分析表明其与H5N2亚型禽流感美国分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性高达97%以上,由此该分离株鉴定为H5N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Parrot/Guangdong/268/2005。     

两株鸭源H1N3亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

从2008年10月至2010年7月,每月定期在华东地区扬州活禽市场采集健康家鸭泄殖腔拭子,并从中分离鉴定了14株H1亚型禽流感病毒。对其中的2株病毒进行全基因测序和遗传演化分析,发现2株病毒均属于H1N3低致病性禽流感病毒。各基因遗传进化分析均与类禽猪流感的分离株的亲缘关系相对较近;除血凝素(haemagglutini,HA)基因外,其它所有的基因均发生了不同程度基因重组。其中H5N1病毒参与了多聚酶蛋白PB1与PB2基因的重组,H9N2病毒参与了PA基因的重组。     

1株西藏H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的遗传进化分析

分析1株西藏H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化特征。利用RT-PCR法对H5亚型抗原阳性流感病毒核酸检测,并分子克隆、核苷酸测序,再利用DNASTAR、MEGA7.0软件进行同源性分析和基因遗传进化分析。经基因遗传进化分析表明,H5N1亚型禽流感病毒和2012年孟加拉国分离株亲缘关系最近,属于同一分支,HA蛋白裂解位点处有较多碱性氨基酸,从分子上表明西藏毒株H5N1是高致病性禽流感病毒。对西藏分离株H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因进行遗传进化分析,为西藏H5亚型禽流感病毒感染防控具有指导意义。     

H9N2亚型猪流感病毒A／Swine／Shandong／1／02分离株的基因序列分析

从有肺炎症状的病猪中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒（SIV）A／Swine／Shandong／1／02，对其进行了全病毒基因序列分析。结果表明，该毒株8个基因片段的核苷酸序列均来自禽流感病毒（AIV），与我国目前家禽中流行的H9N2亚型AIV毒株具有很高的同源性，与A／Duck／Hong Kong／Y280／97（H9N2）的同源性为94．1％～98．9％，与A／Chicken／Beijing／1／94（H9N2）的同源性为94．5％～98．2％；推导的其血凝素（HA）裂解位点处的氨基酸序列为P—A-R—S-S-R，完全符合H9亚型AIV欧亚分支中的类A／Chicken／Beijing／1／94亚分支的特征；基因分析结果表明，该分离株的所有基因片段均来源于H9N2亚型AIV，它可直接感染猪，并导致发病，但它并未在猪体内发生重组。     

上海市三株H9N2鸭禽流感病毒全基因遗传进化分析

为了解上海市鸭群中H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的遗传变异特征,以及与疫苗株A/Chicken/Shan dong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离,对2007年和2009年分离自上海市鸭气管和泄殖腔样品采用荧光RT-PCR检测,将H9亚型禽流感病毒核酸阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定血凝素（haemagglutin,HA）亚型,随后进行了全基因测序,并结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明：3株分离毒株为H9N2亚型鸭禽流感病毒,HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为PARSSRGLF,符合低致病性禽流感病毒特征,均属于经典的H9N2 Ck/Bei群系;NA基因均属于Y280系;NP、PA基因和A/Goose/Guangdong/1/1996（H5亚型）归为一群;PB2和M基因属于Qa/HK/G1/97系;NS基因仍为Ck/Bei系;2007年的分离株和2009年的分离株在PB1基因上分属不同亚群。3株病毒的HA1基因与疫苗株A/Chicken/Shandong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离均大于7%。由此可见,3株鸭H9N2亚型毒株可能是由不同禽流感病毒基因亚群间发生自然重排的产物,现有疫苗对分离株的保护性需要进一步评估。     

H5N1和H9N2禽流感病毒HA抗原性对比分析和基因免疫研究

根据H9N2和H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因序列，设计合成全基因扩增引物．将RT—PCR扩增2个毒株的HA基因进行序列测定．对推导的氨基酸序列通过MIF Bioinformatics软件进行抗原表位分析和糖基化位点进行分析。构建2个基因的真核表达质粒．检测2个毒株的HA基因疫苗免疫后外周血中HA特异性抗体的效价．并比较HA2个亚型免疫应答特异性的差异。结果表明，2株毒株禽流感病毒血凝素抗原表位和糖基化位点存在较大差异，重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应。两种亚型禽流感的HA基因免疫诱导的对本亚型病毒的抗体应答水平明显高于另一亚型．     

禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank公开发表的H9N2型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计1对引物,用RT-PCR方法成功扩增出H9N2型禽流感病毒分离株A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因,凝胶电泳结果显示,扩增产物为1.7 kb的单一条带,与预期结果相符.将PCR扩增片段连接到pCR2.1-T载体上,重组质粒酶切鉴定正确.序列测定分析结果显示,所获序列与GenBank中收录的H9N2亚型分离株核苷酸同源性最高达99%,与原型毒株A/Furkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)氨基酸同源性为89%.对HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明,此毒株为低致病力毒株.     

H6亚型鸭源流感病毒HA基因序列分析

为了研究H6亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的咽喉拭子样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H6亚型流感病毒,命名为A/duck/Heilongjiang/QG 1/2013(H6).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与我国鸭源禽流感病毒A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的同源性最高,达到97.8％.系统发育树分析进一步证实分离株与A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的亲缘关系最近,共同起源于台湾分离株A/chicken/Taiwan/G23/87 (H6N1).本研究为H6亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.     

一株H9亚型禽流感病毒HA基因的遗传变异分析

对2006年采集的1份禽流感病鸡组织进行RNA抽提后,采用A型流感病毒通用引物进行禽流感病毒HA基因的扩增,并进行T载体克隆及测序,获得了一株H9亚型禽流感病毒的HA序列。序列分析表明,此血凝素基因的ORF由1683个核苷酸组成,编码560个氨基酸,属A／Chicken／Beijing／1／94系。将其在GenBank中Blasl后发现,其与1株珍珠鸡H9N2病毒（A／Guineafowl／Hongkong／NT101／03）和1株鸡H9N2病毒（A／Chicken／Hongkong／AP45／03）的同源性和分值最高,同源性可达97％,较中国2006年前的分离株进化相对稳定,核苷酸的变异不大。切割位点的序列为-PARSSRGLF-,仍属于低致病力毒株。但Gln226Leu的变异,使其成为一种潜在的可感染人的禽源毒株。     

1株野鸭源禽流感病毒全基因的分子克隆和测序

从2004年8月采自黑龙江扎龙自然保护区的野鸭咽喉和泄殖腔拭子中监测到并成功分离出1株禽流感病毒。经亚型鉴定确定为H4N6型禽流感病毒。命名为A／maliard／ZhaLong／88（H4N6）。携带该病毒的野鸭外观健康，为隐性带毒。对此株禽流感病毒基因组的8个节段进行全序列扩增并测序，并与GenBank上发表的不同来源的H4亚型禽流感病毒进行核苷酸及氨基酸序列的同源性比较，分析了遗传变异关系及此株病毒的潜在致病力特点。     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒（AIV）分离株血凝素（HA）基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析.结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸.2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79（H7N1）的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94（H7N2）株同源性很低（仅65.0%）,而与以色列、意大利H7N2 AIV的同源性较高（为96%～97%）;2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内.推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸（R-）残基,符合低致病力AIV的基因特征.     

H3亚型鸭源流感病毒分离鉴定及HA基因序列分析

为了研究H3亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的粪便样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H3亚型流感病毒,命名为A/Duck/Heilongjiang/1/2014(H3N2).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与韩国水鸟的H3N2亚型AIV A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005的同源性最高,达到94.6％.系统发育树分析进一步证实分离株可能来源于韩国的水鸟.本研究为H3亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.     

一株野鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/mallard/Yancheng/2005的全基因组克隆和序列分析

应用流感病毒通用引物对盐城珍禽自然保护区野鸭泄殖腔棉拭子分离株禽流感病毒A/mallard/Yancheng/2005（简称Mallard/YC/2005）（H4N6）进行全基因组序列扩增,结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明,Mallard/YC/2005（H4N6）HA基因与A/duck/Siberia/1701/1996（H4N6）的核苷酸同源性最高（97.5%）,推导的氨基酸剪切位点序列为PEKASR,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列;神经氨酸酶（NA）、非结构蛋白（NS）均没有氨基酸缺失;基质蛋白2（M2）与宿主特异性有关的位点及碱性聚合酶2（PB2）的627位都是亲禽类细胞的氨基酸;M基因与家鸭分离株A/duck/Yangzhou/02/2005（H8N4）的核苷酸同源性为99.4%,PA基因与家鸭分离株A/duck/Jiangxi/1286/2005（H5N2）的核苷酸同源性达98.9%,说明这2个基因已经在家鸭体内存在并参与了基因重排。