橡胶树前纤维蛋白（profilin）基因家族的鉴定及表达分析

肌动蛋白细胞骨架可能在橡胶树乳管伤口堵塞过程中发挥重要作用。前纤维蛋白（profilin）是肌动蛋白动态平衡的重要调节子,但对橡胶树profilin基因家族系统研究的报道较少。通过分析橡胶树基因组和转录组数据,鉴定到6个橡胶树profilin基因,对其基本特性及蛋白保守基序、结构特征、进化关系和表达模式等进行分析。基因结构分析表明,橡胶树profilin基因都包含3个外显子2个内含子,编码的蛋白序列含有profilin蛋白特有的保守基序KYMVIQGE和VIRGKKG。进化分析显示,橡胶树profilin并未严格分为营养型和生殖型2种类型。profilin蛋白二级结构以无规则卷曲为主,三级结构均包含3个α螺旋和7个β折叠。表达分析结果显示,4个profilin基因在胶乳中高表达,橡胶树排胶和碘化钾处理调控这4个profilin基因表达,推测profilin基因参与橡胶树排胶过程。该研究结果为进一步阐明橡胶树profilin基因在乳管伤口堵塞和排胶中的作用奠定基础。     

天然橡胶生物合成相关基因表达与橡胶产量的相关性

胶乳被认为是橡胶树的一种与伤害应答相关联的保护物质。割胶可以显著促进橡胶生物合成,且此促进作用与激活乳管细胞中橡胶生物合成相关基因的表达相关,但相关性大小尚不清楚。本文通过qPCR分析了正常割胶条件下,6个橡胶生物合成相关基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981°IRRDB种质胶乳中的表达情况。结果显示：这6个基因在魏克汉种质中的表达水平显著高于1981°IRRDB种质,分别是后者的1.05~14.62、0.97~4.26、1.46~12.56、0.83~2.99、0.43~7.54、1.92~11.31倍,平均值是后者的7.54、2.55、5.69、1.71、2.71、4.91倍。相关性分析表明,这些基因的表达与橡胶树干胶产量呈正相关,其中,HbREF和HbGAPDH的表达水平与干胶产量之间的相关性最高,有望作为橡胶树产量育种的分子指标。     

橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析

小热激蛋白（small heat shock protein, sHSP）是一类胁迫诱导蛋白,不仅参与植物发育还响应生物与非生物胁迫。本研究通过分析转录组数据获得橡胶树12个sHSP基因家族成员。生物信息学分析和表达谱分析结果表明：蛋白保守结构预测显示12个sHSP均具有α-晶体蛋白保守结构域;二级结构预测结果显示,12个sHSP均由α-螺旋、β-转角、延伸链和大量的随机卷曲组成。通过RT-PCR技术分析,结果发现这12个sHSP家族基因在橡胶树不同组织和叶片不同发育时期中表达有明显差异,HbsHSP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP17.3、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.5、HbsHSP22.6和HbsHSP23.9在胶乳中高表达,HbsHSP17.4在树皮中高表达,HbsHSP17.5a在树茎中高表达,HbsHSP25.8则在树叶中表达量最高。乙烯利处理后,12个sHSP家族基因的表达总体呈下降趋势。在不同死皮等级橡胶树中12个sHSP家族基因的表达也具有明显差异,与健康树相比,HbsHSP15.8、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.6、HbsHSP23.9和HbsHSP25.8在死皮树中的表达量呈下降趋势;HbsHSP16.2、HbsHSP17.3和HbsHSP22.5的表达量呈上升趋势。因此推测橡胶树sHSP家族基因可能参与橡胶树生物与非生物逆境胁迫响应,以及可能在乙烯作用途径中发挥作用。     

巴西橡胶树多聚遍在蛋白基因的表达分析

研究中发现橡胶树胶乳中的橡胶粒子膜上存在遍在蛋白（Ubiquitin)，天然橡胶就是在橡胶粒子上合成的，一些与橡胶合成相关的酶或蛋白就位于橡胶粒子膜上，为了探讨多聚遍在蛋白（Polyubiquitin)基因在天然橡胶合成中可能的调节作用，对橡胶树Polyubiquitin基因的表达进行了研究，Northern blot分析表明，Polyubiquitin基因在橡胶树叶片，树皮和胶乳中都表达，在胶乳中的表达量比叶片和树皮中的高。用外源乙烯和茉莉酸处理的末开割橡胶树和开割橡胶树进行处理后，均可引起Polyubiquitin基因表达增强，未开割橡胶树对外源乙烯和茉莉酸处理比开割橡胶树的反应敏感。     

澳洲坚果MiSTPP3和MiSTPP7基因克隆与表达分析

以澳洲坚果品种‘O.C.’为试材,利用RT-PCR技术克隆获得2个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶基因,分别命名为MiSTPP3和MiSTPP7,其编码序列长度分别为2095 bp和1700 bp。序列分析和系统进化分析表明,MiSTPP3含有MPP_PP5_C结构域,属于PP5亚家族;MiSTPP7含有MPP_PP7结构域,属于PP7亚家族。蛋白理化性质和亚细胞定位分析表明,MiSTPP3是一个稳定的亲水性蛋白,可能定位于质膜;MiSTPP7是一个不稳定的亲水性蛋白,可能定位于线粒体基质。生物信息学分析表明,MiSTPP3和MiSTPP7都是非分泌跨膜蛋白,其二级和三级结构的主要元件都是α螺旋、无规则卷曲和延伸链。RT-qPCR分析表明,MiSTPP3和MiSTPP7在澳洲坚果根、茎、叶、花和小果中都有不同的表达量;MiSTPP3受低温胁迫下调表达,而MiSTPP7上调表达,且二者都受干旱胁迫上调表达。因此,推测MiSTPP3和MiSTPP7可能参与澳洲坚果的生长发育及逆境胁迫反应。     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。     

橡胶树F3’H基因克隆及其功能分析

从橡胶树叶片转录组数据库中调取花青素合成途径中的关键酶类黄酮3’-羟化酶（F3’H）基因序列信息,通过RT-PCR扩增得到2个橡胶树F3’H基因,分别命名为HbF3’H1和HbF3’H2。通过荧光定量PCR分析发现,只有HbF3’H1基因在不同发育时期的橡胶树叶片和嫩茎中的表达水平与花青素的合成积累趋势完全一致。HbF3’H1所编码的蛋白属于P450超家族,具有保守的F3’H结构域,而且HbF3’H1基因的启动子中包含多种环境效应元件,说明HbF3’H1基因的表达受环境因子调控。通过农杆菌转化烟草发现,过表达HbF3’H1基因的烟草花瓣大量累积花青素,其颜色较非转基因烟草显著加深,同时,荧光定量PCR发现HbF3’H1表达水平与转基因烟草花瓣颜色呈正相关,说明HbF3’H1基因表达促进花青素的累积。本研究为阐明橡胶树花青素代谢途径奠定基础。     

橡胶树PGAM基因的克隆及表达特性分析

从橡胶树中克隆并获得磷酸甘油酸变位酶基因（HbPGAM），该基因的cDNA序列全长1 559 bp，包含长度为1 260 bp的完整开放阅读框，编码一个由419个氨基酸残基组成的蛋白，氨基酸同源性分析发现，该蛋白含有保守的磷酸变构酶组氨酸磷酸酶结构域，属于磷酸甘油酸变位酶。生物信息学分析显示，HbPGAM蛋白无导肽酶切位点，不具有跨膜结构域且为亲水蛋白，该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明，HbPGAM基因在分析的7种组织中均表达，但在胶乳（产胶细胞乳管的细胞质）中的表达水平最高，且该基因在胶乳中的表达受割胶影响，推测其参与橡胶树胶乳再生过程。此外，HbPGAM基因表达受部分植物激素如乙烯利ET、植物生长素2,4-D及水杨酸SA调控，但调控不明显。结果说明，胶乳再生过程中HbPGAM对胶乳糖酵解起到一定的调控作用，为全面了解橡胶树PGAM家族奠定理论基础。     

巴西橡胶树HbGRF基因的克隆、物理定位及表达分析

生长调控因子（growth-regulating factors,GRF）是植物特有的一类转录因子,该转录因子家族成员数目较多,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。以巴西橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为材料,通过RT-PCR方法进行HbGRF基因的克隆;利用生物信息学的方法对其蛋白序列、理化性质、基因结构、进化关系进行分析;利用IS-PCR技术和FISH技术对其进行物理定位分析;采用qRT-PCR对橡胶树中HbGRF基因的表达模式进行研究。结果表明：在橡胶树雌花中克隆到3个GRF基因,分别命名为HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3,分子量分别为65.663、41.188、52.858 kDa,其编码的蛋白长度分别为609、384、494 aa,均为不稳定蛋白;3个基因均具有GRF完整的特征结构域WRC和QLQ,分别属于3个不同亚族。基因物理定位结果表明,HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因分别位于橡胶树染色体的第11号长臂、第5号短臂和第9号长臂上,基因到着丝粒的平均百分距离是77.65、42.66和65.27。表达结果显示,橡胶树3个HbGRF基因在茎尖、雌花等生长旺盛的组织中表达量较高,用外源赤霉素和脱落酸处理后,发现表达量呈上升趋势,经过48 h后表达量和初始值基本持平,3个基因在茎尖、雌花中有明显的表达特异性,可能在橡胶树花芽分化及雌花的发育过程中起到了重要作用。该结果为研究橡胶树HbGRF基因的功能及作用机制奠定了理论基础,为橡胶树精准育种提供了分子细胞学依据。     

橡胶树α-维管蛋白基因HbTUA1的克隆及表达分析

利用橡胶树胶乳EST文库克隆到一个TUA基因,命名为HbTUA1（GenBank登录号：KC333454）。该基因cDNA全长1 580 bp,其中5′UTR长45 bp,3′UTR长167 bp,编码区长1 368 bp,编码449个氨基酸。HbTUA1蛋白具有TUA类蛋白保守的GTP结合域。荧光定量PCR分析显示,HbTUA1基因在橡胶树胶乳中的表达量最高,其次是树皮和芽,而在种子和叶片中的表达量最低;在胶乳中,HbTUA1基因的表达显著受割胶和伤害诱导,在不同死皮程度的橡胶树中也存在明显差异。初步表明HbTUA1基因可能参与橡胶树胶乳再生与胁迫应答调控。     

橡胶树不同粒径橡胶粒子结合凝集相关蛋白的分析

橡胶树是重要的产胶植物,其树皮组织中的次生乳管是合成和贮存天然橡胶的主要组织。天然橡胶是从乳管中的胶乳中提炼而成,由特殊的细胞器-橡胶粒子合成。橡胶粒子为半个单位膜的球状结构,内部贮存合成的天然橡胶,外周膜上结合有多种蛋白质,这些蛋白与其执行的功能密切相关。目前对天然橡胶合成相关蛋白的研究较多,对与橡胶粒子凝集相关的蛋白研究甚少。以‘RY7-33-97’胶乳为材料,利用不同的离心速度,分级分离获取不同粒径的橡胶粒子,并进行不同程度的清洗,以Tricine-SDS-PAGE以及Western-blotting技术对橡胶粒子上结合的蛋白进行比较分析。研究结果表明,不同粒径的橡胶粒子上结合的蛋白含量存在差异。小橡胶粒子膜蛋白（SRPP）随着粒径的减小含量明显增加;而橡胶延伸因子蛋白（REF）的含量基本维持稳定,与粒径大小关系不大。存在于C-乳清中的Hev b7胶乳过敏原蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）与橡胶粒子有明显的结合;存在于黄色体B-乳清中的β-1,3-葡聚糖酶（Glu）、橡胶素（Hev）和几丁质酶（Chit）均能与橡胶粒子结合,但几丁质酶与之的结合能力最弱。橡胶粒子经清洗后,作为橡胶粒子的主要膜蛋白,SRPP含量随着清洗次数增加明显降低,而REF蛋白含量变化不明显,可见SRPP与橡胶粒子膜的结合紧密程度不如REF;来自C-乳清和B-乳清的凝集相关蛋白随清洗次数增加也明显降低含量。体外孵育小橡胶粒子与不同的蛋白样品,结果表明,橡胶粒子可体外结合多种不同的蛋白,其中多种蛋白都与橡胶粒子的凝集有关。本研究对不同粒径橡胶粒子上结合的凝集相关蛋白进行了初步解析,旨在为阐明橡胶树排胶机制奠定基础。     

橡胶树PR107和CATAS8-79中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定

橡胶树是合成天然橡胶的重要植物。PR107和CATAS8-79是具有不同产排胶性状的2个无性系。在以往的研究中,胶乳中蛋白表达差异被认为是影响天然橡胶合成的关键因子之一。然而,这2个无性系之间与胶乳产量相关的蛋白质图谱尚未明确。本研究采用蛋白质组学方法对这些蛋白质进行鉴定,有助于探讨巴西橡胶树胶乳合成机理。经双向凝胶电泳和质谱鉴定分析,共获得65个差异表达蛋白信息。通过磷酸化蛋白质组分析,在PR107胶乳中鉴定出31个磷酸化蛋白质,含有74个磷酸化氨基酸残基,在CATAS8-79胶乳中鉴定出80个磷酸化蛋白质,含有166个磷酸化氨基酸残基。橡胶延伸因子/小橡胶粒子蛋白（REF/SRPP）家族成员被鉴定为差异表达蛋白和磷酸化修饰蛋白,这些蛋白在调节天然橡胶合成中起着重要作用。pro-hevein和hevamine也表现出不同的磷酸化修饰水平,它们主要在天然橡胶排胶过程中起作用。一种丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶激酶的磷酸化和去磷酸化修饰可能在天然橡胶合成中起调节作用。这些结果为天然橡胶生物合成调控机制的研究提供了新的理论依据。     

橡胶粒子膜蛋白双向电泳体系的建立和质谱初步分析

橡胶粒子是橡胶树乳管细胞中进行橡胶生物合成的一种特殊细胞器。参与橡胶生物合成的橡胶转移酶、橡胶延长因子等重要酶类和相关的蛋白质调控因子均定位于橡胶粒子的表面或镶嵌于橡胶粒子膜中。本研究在SDS-PAGE分离橡胶粒子膜蛋白的基础上,使用pH3￣10非线性IPG胶条进行2-DE双向电泳,成功地分离了橡胶粒子膜蛋白,在2-DE银染胶上共得到约520个蛋白质点,并通过基质辅助激光解吸附飞行质谱(MALDI-TOF)对部分蛋白质点进行了初步分析鉴定。检索蛋白质数据库证明其中的蛋白质点包括橡胶延长因子(REF)和橡胶过敏蛋白Hev3等典型的橡胶粒子膜蛋白,另外还有一些功能未知的蛋白质。从银染2-DE胶上可以看出,REF在橡胶粒子膜蛋白中占有很大的比例,这表明REF在橡胶生物合成中可能具有非常重要的作用。通过比较蛋白质组学研究发现,橡胶粒子膜上存在乙烯和茉莉酸信号响应蛋白。乙烯和茉莉酸对橡胶生物合成的调控作用可能与橡胶粒子膜上存在它们的响应蛋白有关。橡胶粒子膜蛋白2-DE双向电泳体系的建立为全面研究橡胶粒子膜蛋白的组成及其变化奠定了基础。     

橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞的组织化学和分子生物学研究

橡胶树乳管分化研究主要以树皮为研究材料。本研究通过组织化学染色法、尼罗红荧光染色法、免疫组织化学法和分子生物学方法证实橡胶树叶柄来源的愈伤组织中存在乳管细胞。乳管细胞在叶柄愈伤组织中随机分布,分布模式类似橡胶树初生乳管;叶柄愈伤组织乳管细胞在发育早期时橡胶粒子较少,在发育后期时充满橡胶粒子。RT-PCR扩增出叶柄愈伤组织乳管细胞的橡胶延伸因子(REF)、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、橡胶凝集素(hevein)和橡胶转移酶(CPT)等胶乳特异基因的转录本,经比对它们序列与所报道的橡胶树树干胶乳中表达的基因序列一致,表明橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞拥有树皮乳管细胞相似的功能,为叶柄愈伤组织作为一种新型的研究乳管分化的模式提供了科学依据。     

橡胶树KT/HAK/KUP基因家族成员的鉴定与表达分析

为研究巴西橡胶树钾转蛋白(KT/HAK/KUP)基因家族在生长发育和逆境胁迫方面的生物学功能,从橡胶树基因组中鉴定得到31个KT/HAK/KUP基因家族成员,并从基因结构、染色体定位、系统进化和表达分析等方面进行全面系统的分析.研究结果发现,KT/HAK/KUP基因家族31个成员分布在3个Contig和15个染色体上,...     

橡胶树树皮中ACC氧化酶基因（HbACO7）的表达特性及功能探究

天然橡胶是重要的工业原材料,主要来自橡胶树树皮中的乳管。乙烯能促进橡胶树乳管产胶和排胶,在树皮上施用乙烯利（一种乙烯释放剂）或乙烯可显著提高胶乳产量。基于本课题组前期获得的橡胶树基因组和转录组数据,克隆橡胶树中乙烯合成通路关键酶——1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8个家族基因,研究其组织表达模式。结果表明：在分析的7种组织中,尽管HbACO基因存在不同程度的冗余表达,但每种基因的组织表达模式具有明显的特异性,其中HbACO7是树皮中表达量最高的家族基因。HbACO7基因的表达在割胶季节的不同月份发生明显变化,其中在8月的表达量最高。成功构建了HbACO7基因的原核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21中的诱导表达。纯化后的HbACO7重组蛋白具有明显的ACO酶催化活性,成功地催化了乙烯的体外合成。该结果将为后续橡胶树树皮中的乙烯生物合成调控机制研究提供参考。     

橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中,为获得可靠的基因表达结果,筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料,收集其中的胶乳,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件,综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证,筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b,其中ejf2是最佳内参基因,18S不适合作为本研究的内参基因。     

橡胶树‘热研7-33-97’和‘PR107’胶乳和树皮中蔗糖代谢相关的酶活与基因表达研究

对2个产胶水平差异明显的橡胶树品种（‘热研7-33-97’和‘PR107’）产胶旺季时2个与产胶直接相关的碳库（胶乳和茎干树皮）中蔗糖代谢相关的酶活、基因表达以及胶乳生理参数、树皮非结构性碳水化合物（NSC）含量进行了比较研究。结果表明：‘PR107’干胶产量的季节性变动明显大于‘热研7-33-97’,但均在9月底出现一个产胶高峰;2个品种胶乳的总固形物、无机磷和蔗糖含量差异不明显,但‘热研7-33-97’的干胶含量显著高于‘PR107’;树皮NSC的主要成分为可溶性糖（占80%以上）,但品种间的NSC及其相关组分（淀粉、可溶性糖和还原性糖）的差异均不显著;胶乳中,蔗糖合成酶（Sus）主要催化蔗糖合成,品种间的中碱性转化酶（NIN）和Sus酶活差异均不显著;树皮中,‘热研7-33-97’的NIN酶活显著大于‘PR107’,而其他蔗糖代谢相关酶活品种间的差异不显著;在胶乳中,HbSWEET10a基因的表达量高,并且‘热研7-33-97’>‘PR107’,还是唯一在品种间表达显著差异的蔗糖代谢相关基因;在树皮中,‘PR107’的HbSus3和细胞壁转化酶基因HbCIN2的表达显著高于‘热研7-33-97’,HbSUT5显著低于‘热研7-33-97’,而其他4个蔗糖代谢相关基因的表达在品种间差异不显著。本研究结果为深入探究蔗糖代谢调控与胶乳再生的互作奠定了基础。