巴西橡胶树橡胶粒子研究进展

橡胶粒子是橡胶树乳管细胞质中进行橡胶生物合成的一种特殊细胞器,其内部的主要成分橡胶烃分子,是天然橡胶的直接来源.橡胶生物合成是在橡胶粒子膜上进行的,橡胶转移酶和橡胶延长因子等是参与橡胶生物合成的重要橡胶粒子膜蛋白.它们决定着橡胶粒子的橡胶生物合成速率,并影响橡胶树胶乳产量和橡胶质量.橡胶粒子膜上存在与橡胶生物合成相关的茉莉酸和乙烯信号响应蛋白,茉莉酸、乙烯可能是通过橡胶粒子膜上的茉莉酸、乙烯信号响应蛋白对橡胶生物合成产生调控作用.从橡胶粒子的基本结构、起源和发育、橡胶粒子膜蛋白的组成和功能3个方面对橡胶粒子细胞组织学和分子生物学的研究进展进行综述.可为橡胶树产胶生理学的深入研究提供参考.     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。     

橡胶树 HMGS 编码基因的分离鉴定

羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 合成酶（HMGS）将乙酰辅酶 A 转化为羟甲基戊二酸单酰辅酶 A,是甲羟戊酸代谢 途径的限速酶之一。本研究从橡胶树热研 879 和热研 7-33-97 品系的胶乳中分离出 HbHMGS1 和 HbHMGS2 基因。相比 HbHMGS1 基因在胶乳和树皮中的共表达模式,胶乳中高丰度表达的 HbHMGS2 基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶合 成的主效基因,而 HbHMGS1 是功能冗余基因。HbHMGS2 基因在橡胶树高产品系热研 879 胶乳中的表达量亦高于测序 品系热研 7-33-97,表明 HbHMGS2 基因的高水平表达可能有助于橡胶的合成。其上游启动子的顺式作用元件差异可能 与该基因在热研 879 和热研 7-33-97 的差异表达有关。HbHMGS2 基因的转录亦受茉莉酸诱导,可能参与了茉莉酸信号 调控天然橡胶的合成过程。HbHMGS2 基因在大肠杆菌中成功表达为后续研究该基因的功能、利用该基因生产活性物质 提供新的基因资源。     

橡胶树树皮中ACC氧化酶基因（HbACO7）的表达特性及功能探究

天然橡胶是重要的工业原材料,主要来自橡胶树树皮中的乳管。乙烯能促进橡胶树乳管产胶和排胶,在树皮上施用乙烯利（一种乙烯释放剂）或乙烯可显著提高胶乳产量。基于本课题组前期获得的橡胶树基因组和转录组数据,克隆橡胶树中乙烯合成通路关键酶——1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8个家族基因,研究其组织表达模式。结果表明：在分析的7种组织中,尽管HbACO基因存在不同程度的冗余表达,但每种基因的组织表达模式具有明显的特异性,其中HbACO7是树皮中表达量最高的家族基因。HbACO7基因的表达在割胶季节的不同月份发生明显变化,其中在8月的表达量最高。成功构建了HbACO7基因的原核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21中的诱导表达。纯化后的HbACO7重组蛋白具有明显的ACO酶催化活性,成功地催化了乙烯的体外合成。该结果将为后续橡胶树树皮中的乙烯生物合成调控机制研究提供参考。     

割胶、机械伤害和外源茉莉酸对橡胶树乳管细胞防卫蛋白基因表达的影响

为了进一步探明巴西橡胶树乳管的防卫功能,笔者采用RT-PCR和Northem-blot技术分析割胶、机械伤害和外源茉莉酸对胶乳几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和橡胶素基因表达的影响,结果表明:(1)外源茉莉酸和机械伤害均能上调几丁质酶、β-l,3-葡聚糖酶和橡胶素的基因表达,但机械伤害的效应滞后于外源茉莉酸;(2)几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和橡胶素的基因在割胶树中的表达明显强于在未开割树中的表达;(3)割胶树胶乳中内源茉莉酸含量显著高于未开割树.     

橡胶树不同粒径橡胶粒子结合凝集相关蛋白的分析

橡胶树是重要的产胶植物,其树皮组织中的次生乳管是合成和贮存天然橡胶的主要组织。天然橡胶是从乳管中的胶乳中提炼而成,由特殊的细胞器-橡胶粒子合成。橡胶粒子为半个单位膜的球状结构,内部贮存合成的天然橡胶,外周膜上结合有多种蛋白质,这些蛋白与其执行的功能密切相关。目前对天然橡胶合成相关蛋白的研究较多,对与橡胶粒子凝集相关的蛋白研究甚少。以‘RY7-33-97’胶乳为材料,利用不同的离心速度,分级分离获取不同粒径的橡胶粒子,并进行不同程度的清洗,以Tricine-SDS-PAGE以及Western-blotting技术对橡胶粒子上结合的蛋白进行比较分析。研究结果表明,不同粒径的橡胶粒子上结合的蛋白含量存在差异。小橡胶粒子膜蛋白（SRPP）随着粒径的减小含量明显增加;而橡胶延伸因子蛋白（REF）的含量基本维持稳定,与粒径大小关系不大。存在于C-乳清中的Hev b7胶乳过敏原蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）与橡胶粒子有明显的结合;存在于黄色体B-乳清中的β-1,3-葡聚糖酶（Glu）、橡胶素（Hev）和几丁质酶（Chit）均能与橡胶粒子结合,但几丁质酶与之的结合能力最弱。橡胶粒子经清洗后,作为橡胶粒子的主要膜蛋白,SRPP含量随着清洗次数增加明显降低,而REF蛋白含量变化不明显,可见SRPP与橡胶粒子膜的结合紧密程度不如REF;来自C-乳清和B-乳清的凝集相关蛋白随清洗次数增加也明显降低含量。体外孵育小橡胶粒子与不同的蛋白样品,结果表明,橡胶粒子可体外结合多种不同的蛋白,其中多种蛋白都与橡胶粒子的凝集有关。本研究对不同粒径橡胶粒子上结合的凝集相关蛋白进行了初步解析,旨在为阐明橡胶树排胶机制奠定基础。     

巴西橡胶树HbSAP1基因克隆及表达分析

胁迫相关蛋白(Stress associated proteins,SAPs)在植物免疫应答和胁迫反应中发挥着重要作用。采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,从巴西橡胶树中分离胁迫相关蛋白基因Hb SAP1。结果表明:Hb SAP1基因的开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Hb SAP1蛋白预测分子量为18.87 ku,等电点为7.98,具有典型的A20和AN1锌指结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,Hb SAP1基因在巴西橡胶树各组织中均有表达,以茎尖中的表达量最高。同健康橡胶树相比,Hb SAP1基因在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量显著升高。伤害、H2O2、乙烯利及茉莉酸甲酯处理均能使胶乳中Hb SAP1基因的表达上调。低温及PEG诱导的干旱胁迫下,Hb SAP1基因在叶片中的表达显著增强。上述结果表明,Hb SAP1基因可能在橡胶树死皮发生、非生物胁迫应答、乙烯及茉莉酸信号转导中发挥重要调控作用。     

巴西橡胶树胶乳表达ABC转运蛋白HbGCN1的克隆与表达研究

橡胶生物合成是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢,它是影响橡胶产量的首要因素。ABC转运蛋白(ATP Binding Cassette transporter,ABC transporter)是一类与植物次生代谢密切相关的蛋白大家族。筛选已构建的茉莉酸诱导橡胶树胶乳消减文库,并克隆了1个GCN(general control non-repressible)亚族ABC转运蛋白基因EST,通过RACE技术获得其全长cDNA序列,命名为HbGCN1。该基因开放阅读框共1 815 bp,编码605个氨基酸残基。表达分析表明:HbGCN1主要在橡胶树树皮及胶乳中表达,且在乙烯、茉莉酸或伤害诱导下上调表达,推测其可能与橡胶生物合成相关。原核表达该基因,为进一步的研究奠定基础。     

外源茉莉酸诱导巴西橡胶树乳管分化的酶学研究（I）

以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Mull.Arg.）无性系热研7-33-97芽条增殖苗圃中具有3篷稳定叶的萌条和橡胶树无性系RRIM600成龄树为材料，研究外源茉莉对萌条树皮组织的脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酸、过氧化物酶的活性与过氧化物酶同工酶以及对成龄树胶乳和树皮组织脂氧合酶活性的影响。结果表明，⑴外源茉莉酸处理使橡胶树7-33-97萌条第1篷（顶篷）叶和第3篷叶伸长单位树皮组织的脂氧合酶活性升高，外源茉莉酸与脂氧合酶抑制剂去甲二氢愈伤酸（nordigyroguaiaretic acid,NDGA）一起作用时可降低外源茉莉酸对脂氧合酶的诱导效应，并相应地抑制了外源茉莉酸刺激橡胶树乳管分化的作用；⑵外源茉莉酸可显地诱导成龄开割橡胶树RRIM600胶乳的脂氧合酶活性，而对其树皮组织的脂氧合酶活性几乎没有影响；⑶外源茉莉酸大幅度地提高了橡胶树7-33-97萌条第1篷叶和第3篷叶伸长单位树皮组织的茉丙氨酸解氨酶活性；⑷外源茉莉酸处理中，橡胶树7-33-97萌条第1篷叶和第3篷叶伸长单位树皮组织的过氧化物酶对外源茉莉酸的反应不同，即外源茉莉酸对萌条第3篷叶伸长单位树皮组织的过氧化物酶活性及其同工酶谱没有影响，但使萌条第1篷叶伸长单位树皮组织的过氧化物酶活性升高，其同工酶谱也发生了相应的变化。因此，橡胶树萌条次生乳管的分化与树皮组织脂氧合酶和苯丙氨酸解氨酸活性的变化具有一定的联系，而与过氧化物酶可能无关。提出了“外源茉莉酸与机械伤害是通过对橡胶树内源茉莉酸的诱导作用而刺激橡胶树乳管分化”的假说。     

乙烯刺激橡胶树胶乳黄色体蛋白差异初析

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳中的黄色体作为乳管细胞的一种细胞器,其稳定性受乙烯刺激影响。该试验从蛋白差异角度,选取未开割胶树,应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE),比较在乙烯刺激与未刺激条件下,黄色体蛋白的变化情况。结果表明,按蛋白表达量变化差异3倍及以上分析,胶树在乙烯刺激24h后,上调蛋白5个,下调蛋白2个;在乙烯刺激48h后,上调蛋白7个,下调蛋白1个;综合3个处理,先上调后下调的蛋白8个;先下调后上调的蛋白2个。应用质谱技术鉴定了其中部分差异表达蛋白,并进行初步功能分析,表明未开割橡胶树胶乳黄色体受乙烯刺激后,黄色体蛋白发生不同程度复杂变化,各组处理间变化明显。     

热研88-13胶乳中乙烯释放量GC测定方法及其变化

探讨采用毛细管柱气相色谱法测定橡胶树胶乳中乙烯释放量的方法,并初步测定了首次割胶的胶乳中乙烯释放量和乙烯刺激割胶不同割次的乙烯释放量。试验用岛津GC2010型气相色谱仪,采用外标法,以保留时间定性,以峰面积定量,胶乳中乙烯释放量测定结果相对标准偏差（RSD）为1.08%,检出限为0.03μL·L^-1。用气相色谱法测定橡胶树中胶乳的乙烯含量和生成速率有简便、快速、高效、准确、灵敏度高等优点。橡胶树采用乙烯利刺激（S/2d/2＋3.0%ET）,在涂药后第1-5割次的胶乳乙烯释放量分别为：18.62、9.86、3.40、4.90、3.65μL·L^-1,而橡胶树首次割胶（对照）的胶乳中乙烯释放量为2.36μL·L^-1;第1-5割次的胶乳乙烯生成速率分别为：2.83、1.53、0.50、0.67、0.54nL·g^-1·h^-1,而对照的为0.36nL·g^-1·h^-1。结果表明：经乙烯利刺激后,橡胶树胶乳中乙烯释放量和生产速率均呈双峰型变化趋势,其中涂药后第1割次的胶乳中乙烯释放量最高;橡胶树胶乳中乙烯释放量与乙烯生成速率呈极显著正相关,r=0.9997^＊＊。     

巴西橡胶树胶乳中4种植物生长物质的测定

采用酶联免疫检测技术和气相色谱法测定了巴西橡胶树胶乳中生长素(IAA)、细胞分裂素(iPAs)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)等4种植物生长物质的含量。结果表明:利用酶联免疫检测技术可检测到巴西橡胶树胶乳中含有较多的IAA,iPAs,ABA。采用气相色谱法(TraceGC气相色谱仪和GC-9V气相色谱仪)可检测到用乙烯利刺激割胶的成年割胶树胶乳中的ET,但在未开割幼树胶乳中未能检测到内源ET。在巴西橡胶同一茎段一定长度范围内,不同的采胶位置IAA,、ABA含量的差异不显著,表明它们量的分布没有位置效应。      

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。     

热研7-33-97幼龄开割树对低频刺激割制的适应性研究初报

研究了速生高产优良无性系热研7-33-97在幼龄开割期对低频刺激割制的适应性。3a结果表明，该品种在幼龄开割期使用低频乙烯利刺激割胶表现出胶乳再生能力强、用于生长的干物质分配率高、排胶速度快等生理特性。采用低频、短线、少药等技术措施，有利于胶树的产胶与生长。     

Long-term effect of ethylene stimulation on the yield of rubber trees is linked to latex cell biochemistry

Ethylene stimulation with ethephon (2-chloroethylphosphonic acid) is nowadays essential for increasing latex production in the rubber tree (Hevea brasiliensis): both small-scale planters and agro-industrial plantations worldwide use ethephon. Ethylene stimulation strongly influences cumulative yield and latex cell biochemistry. The purpose of this study was to characterize the long-term behaviour of the rubber tree under ethephon treatment. Over a period of 7 years in Côte d’Ivoire, West Africa, the effect of eight frequencies of ethylene stimulation on yield and latex cell biochemistry was compared in four rubber trees clones, IRCA 130, IRCA 230, GT 1, and PB 217. The ability of the trees to produce more latex under ethylene stimulation was related to the sucrose and inorganic phosphorus contents of the latex cells. For high-yield clones with low sugar content and high inorganic phosphorus content like IRCA 130, namely quick starter clones, no stimulation was necessary to improve yield. For clones like IRCA 230, with higher sugar content, eight ethylene stimulations per year was the optimum frequency to obtain the highest yield. The effect of ethylene stimulation on latex yield increase was significant in clones with high sucrose content and low inorganic phosphorus content such as PB 217. These clones, namely slow starter clones, needed more stimulation to produce more, but in the longer run there were no negative effects of ethylene on the latex yield. These results will help planters optimize latex production by choosing the most appropriate ethylene stimulation to clones according to their latex cells biochemistry.     

The growth and yield of rubber at maturity is improved by intercropping with banana during the early stage of rubber cultivation

Intercropping with short-term crops provides a significant additional income during the long immature period of rubber tree growth when no latex is produced. Much previous evidence has demonstrated that the growth of young rubber trees is unaffected by the presence of an intercrop. However, few, if any studies have however been conducted to date to assess the effects of intercropping on subsequent growth and yield of rubber once the companion intercrop is removed. This study demonstrates for the first time that intensive intercropping of young rubber with banana may result not only in a sustained increase in growth and yield of rubber trees but also a reduction in the length of the unproductive immature phase.Rubber was grown either as a sole crop, or intercropped for the first 4 years with banana. The intercrop comprised an additive series of one, two or three rows of banana to one row of rubber. Growth of rubber was monitored for 6 years, i.e. up to the time that tapping for latex began and a logistic growth function was fitted to girth data in order to assess growth. Intercropping had a positive effect on the growth of rubber throughout the 6 years of the study, with the result that trees in the intercrop treatment were ready for tapping 4 months earlier than in the sole crop. Whilst girth and height were greater in the intercrops, bark thickness was similar to that of the sole crop. Intercrop treatments had no effect on latex yield per plant, but yield per hectare was greater in the intercrop than sole crop treatments due to a higher number of tappable trees.     

超高产橡胶芽接树的树皮结构特征

据数年来的观测表明,在生产实践中出现有少量的植株(称其为"超高产橡胶芽接树"),其单株产胶量约达当地普通橡胶芽接树平均单株产胶量的15～20倍.为了探索这些超高产芽接树高产的原因.对砧木为无选择种子砧木,接穗为PB86的树干割线上10 cm背面的树皮和输导根的结构进行了研究.结果表明,超高产橡胶芽接树树干有输导功能韧皮部的厚度、幼嫩乳管列数、总乳管列数、幼嫩乳管列占总乳管列比例、乳管口径和筛管口径均显著大于普通芽接树.特别是超高产芽接树有输导功能韧皮部乳管列数与有输导功能韧皮部细胞层数的比值显著大于普通芽接树;另外,超高产橡胶芽接树输导根的皮层薄壁细胞厚度和皮层薄壁细胞层数显著小于普通芽接树,而导管口径却显著地大于对照(普通芽接树),这表明超高产橡胶芽接树形成层分化为乳管的能力、营养物质和水分运输能力都强于对照株.     

巴西橡胶树胶乳生理诊断的研究与应用

橡胶树胶乳生理诊断法是一批法国学者于20世纪80年代发展起来的,用于判断胶树代谢与健康状况的方法。在研究了巴西橡胶树胶乳的各种成分在胶树中的生理功能及其变化规律,以及这些成分与胶树产量之间的相关性后,可以将无性系划分为不同的代谢类型,并根据不同的代谢类型,安排不同的采胶方法 同时也可以根据随机抽样理论找到这些成分的标准参考值,用来判断开割胶树的健康状况,以指导采胶生产。现在胶乳生理诊断主要用于无性系代谢类型判断与采胶强度判断。     

茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库,经蓝白斑筛选共得到121个含有插入片段的阳性克隆。通过菌落PCR的方法分别对阳性克隆的插入片段进行扩增,结果表明,95％左右阳性克隆插入片段的大小在200-600 bp之间。随机选取25个克隆进行测序,并对所得的25条表达序列标签(EST)序列用Blastn(基本局域联配搜寻工具)检索基因文库(genbank),其中10条EST片断可找到碱基序列相似性大于80％以上的同源基因序列,其余15条EST为没有任何功能线索的未知序列。外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建和在此基础上克隆橡胶树胶乳中JA信号的候选应激基因,将为开展茉莉酸调控橡胶树胶乳代谢和橡胶生物合成的分子机理研究打下基础。