巴西橡胶树胶乳黄色体中多酚氧化酶的活性及其橡胶粒子凝集作用的研究

橡胶粒子凝集在乳管伤口堵塞中起重要作用,研究胶乳中橡胶粒子凝集相关蛋白对于阐明乳管伤口堵塞机制具有重要的意义。对巴西橡胶树初生乳管和次生乳管胶乳黄色体中的多酚氧化酶活性进行了检测,并分析了多酚氧化酶对橡胶粒子凝集的影响。结果表明,初生乳管和次生乳管胶乳的B-乳清蛋白种类有明显差异,但B-乳清都有较高的多酚氧化酶（PPO）活性和具有明显的凝集橡胶粒子的作用。标准PPO也具有凝集橡胶粒子的效应。DTT对标准PPO的活性具有明显的抑制效果,并抑制其对橡胶粒子的凝聚作用。本研究首次证明巴西橡胶树的初生乳管和次生乳管的胶乳黄色体中都含有PPO蛋白,PPO是有效凝聚橡胶粒子的蛋白质成分之一,为深入研究乳管伤口堵塞机制奠定了基础。     

橡胶树PR107和CATAS8-79中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定

橡胶树是合成天然橡胶的重要植物。PR107和CATAS8-79是具有不同产排胶性状的2个无性系。在以往的研究中,胶乳中蛋白表达差异被认为是影响天然橡胶合成的关键因子之一。然而,这2个无性系之间与胶乳产量相关的蛋白质图谱尚未明确。本研究采用蛋白质组学方法对这些蛋白质进行鉴定,有助于探讨巴西橡胶树胶乳合成机理。经双向凝胶电泳和质谱鉴定分析,共获得65个差异表达蛋白信息。通过磷酸化蛋白质组分析,在PR107胶乳中鉴定出31个磷酸化蛋白质,含有74个磷酸化氨基酸残基,在CATAS8-79胶乳中鉴定出80个磷酸化蛋白质,含有166个磷酸化氨基酸残基。橡胶延伸因子/小橡胶粒子蛋白（REF/SRPP）家族成员被鉴定为差异表达蛋白和磷酸化修饰蛋白,这些蛋白在调节天然橡胶合成中起着重要作用。pro-hevein和hevamine也表现出不同的磷酸化修饰水平,它们主要在天然橡胶排胶过程中起作用。一种丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶激酶的磷酸化和去磷酸化修饰可能在天然橡胶合成中起调节作用。这些结果为天然橡胶生物合成调控机制的研究提供了新的理论依据。     

巴西橡胶树多聚遍在蛋白基因的表达分析

研究中发现橡胶树胶乳中的橡胶粒子膜上存在遍在蛋白（Ubiquitin)，天然橡胶就是在橡胶粒子上合成的，一些与橡胶合成相关的酶或蛋白就位于橡胶粒子膜上，为了探讨多聚遍在蛋白（Polyubiquitin)基因在天然橡胶合成中可能的调节作用，对橡胶树Polyubiquitin基因的表达进行了研究，Northern blot分析表明，Polyubiquitin基因在橡胶树叶片，树皮和胶乳中都表达，在胶乳中的表达量比叶片和树皮中的高。用外源乙烯和茉莉酸处理的末开割橡胶树和开割橡胶树进行处理后，均可引起Polyubiquitin基因表达增强，未开割橡胶树对外源乙烯和茉莉酸处理比开割橡胶树的反应敏感。     

中国常用橡胶树品种鉴定方法研究

橡胶树(Hevea brasiliensis)产生的胶乳是天然橡胶的最重要来源,不同品种产生胶乳的能力不同,但不同的橡胶树品种形态差异小,难以区分。利用简单的方法区分不同的橡胶树品种具有重要的意义。以天然橡胶生物合成相关的7个基因家族中的目的基因及启动子序列为模板,设计基因特异的PCR引物16对,分别扩增21个橡胶树栽培品种的基因组DNA,扩增条带的多态性可将19个品种区分开(除了云研77-4和南华1号外)。再利用橡胶小粒子编码蛋白基因(SRPP2)特异的引物,扩增云研77-4和南华1号的SRPP2基因,PCR反应产物直接测序,通过单核苷酸水平上的差异可准确的将二者区分开。本研究通过简单的PCR扩增及其扩增产物的直接测序,建立了一种稳定性好、简单快速、经济高效的鉴定橡胶树品种的方法。     

橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞的组织化学和分子生物学研究

橡胶树乳管分化研究主要以树皮为研究材料。本研究通过组织化学染色法、尼罗红荧光染色法、免疫组织化学法和分子生物学方法证实橡胶树叶柄来源的愈伤组织中存在乳管细胞。乳管细胞在叶柄愈伤组织中随机分布,分布模式类似橡胶树初生乳管;叶柄愈伤组织乳管细胞在发育早期时橡胶粒子较少,在发育后期时充满橡胶粒子。RT-PCR扩增出叶柄愈伤组织乳管细胞的橡胶延伸因子(REF)、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、橡胶凝集素(hevein)和橡胶转移酶(CPT)等胶乳特异基因的转录本,经比对它们序列与所报道的橡胶树树干胶乳中表达的基因序列一致,表明橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞拥有树皮乳管细胞相似的功能,为叶柄愈伤组织作为一种新型的研究乳管分化的模式提供了科学依据。     

橡胶树HbREF3基因的克隆及功能初步分析

橡胶延伸因子（REFs）是橡胶粒子上的一种主要膜蛋白,在橡胶生物合成途径中具有延伸橡胶烃和稳定橡胶粒子等重要作用。对橡胶树不同组织的转录组测序发现,HbREF3在胶乳中具有特异性的高表达,且其在HbREFs基因家族中表达水平也相对较高,仅次于表达丰度最高的HbREF1。HbREF3的开放阅读框为528 bp,编码175个氨基酸,对应的蛋白相对分子质量为19.62 kDa,理论等电点（pI）为5.28。系统进化树分析表明,HbREF3与橡胶树其他HbREFs虽均属于分组Ⅰ,但与HbREF1明显属于不同分支。HbREFs均含有REF保守结构域,但在保守motif的分布上,不同HbREFs蛋白含有保守motif数量不等,HbREF3比HbREF1多了一个motif。生信预测分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,具有14个磷酸化位点。亚细胞定位分析发现HbREF3蛋白定位在内质网上,推测其可能参与橡胶粒子的形成和胶乳的再生。本研究结果为进一步阐明HbREF3基因在橡胶树胶乳再生中的作用机制奠定了基础。     

橡胶粒子膜蛋白双向电泳体系的建立和质谱初步分析

橡胶粒子是橡胶树乳管细胞中进行橡胶生物合成的一种特殊细胞器。参与橡胶生物合成的橡胶转移酶、橡胶延长因子等重要酶类和相关的蛋白质调控因子均定位于橡胶粒子的表面或镶嵌于橡胶粒子膜中。本研究在SDS-PAGE分离橡胶粒子膜蛋白的基础上,使用pH3￣10非线性IPG胶条进行2-DE双向电泳,成功地分离了橡胶粒子膜蛋白,在2-DE银染胶上共得到约520个蛋白质点,并通过基质辅助激光解吸附飞行质谱(MALDI-TOF)对部分蛋白质点进行了初步分析鉴定。检索蛋白质数据库证明其中的蛋白质点包括橡胶延长因子(REF)和橡胶过敏蛋白Hev3等典型的橡胶粒子膜蛋白,另外还有一些功能未知的蛋白质。从银染2-DE胶上可以看出,REF在橡胶粒子膜蛋白中占有很大的比例,这表明REF在橡胶生物合成中可能具有非常重要的作用。通过比较蛋白质组学研究发现,橡胶粒子膜上存在乙烯和茉莉酸信号响应蛋白。乙烯和茉莉酸对橡胶生物合成的调控作用可能与橡胶粒子膜上存在它们的响应蛋白有关。橡胶粒子膜蛋白2-DE双向电泳体系的建立为全面研究橡胶粒子膜蛋白的组成及其变化奠定了基础。     

巴西橡胶树胶乳蛋白质组学研究综述

巴西橡胶树胶乳高速离心后大致可分为橡胶粒子、C-乳清和黄色体3种组分，这些组分中含有约200种不同的蛋白质。随着蛋白质组学的发展，巴西橡胶树胶乳蛋白质组学的研究已相继展开。本文综述近年来巴西橡胶树胶乳蛋白质组学的研究，提出了其存在的问题并进行了展望。     

巴西橡胶树橡胶粒子研究进展

橡胶粒子是橡胶树乳管细胞质中进行橡胶生物合成的一种特殊细胞器,其内部的主要成分橡胶烃分子,是天然橡胶的直接来源.橡胶生物合成是在橡胶粒子膜上进行的,橡胶转移酶和橡胶延长因子等是参与橡胶生物合成的重要橡胶粒子膜蛋白.它们决定着橡胶粒子的橡胶生物合成速率,并影响橡胶树胶乳产量和橡胶质量.橡胶粒子膜上存在与橡胶生物合成相关的茉莉酸和乙烯信号响应蛋白,茉莉酸、乙烯可能是通过橡胶粒子膜上的茉莉酸、乙烯信号响应蛋白对橡胶生物合成产生调控作用.从橡胶粒子的基本结构、起源和发育、橡胶粒子膜蛋白的组成和功能3个方面对橡胶粒子细胞组织学和分子生物学的研究进展进行综述.可为橡胶树产胶生理学的深入研究提供参考.     

一种体外检测橡胶粒子凝集技术的建立

乳管伤口堵塞是限制天然橡胶产量的直接因子,橡胶粒子的凝集在乳管伤口堵塞中起重要作用,分离鉴定橡胶粒子凝集相关蛋白对于揭示乳管伤口堵塞物形成和调节机制具有重要意义.最近,Wititsuwannakul等发明了一种染料结合法检测橡胶粒子体外凝集的技术,笔者对该技术涉及的各个环节进行优化,建立了一种简便、灵敏和重复性好的检测橡胶粒子体外凝集技术.几个关键参数为:(1)使用纯化的小橡胶粒子,适宜浓度为在600nm处的OD值为210～2.5;(2)用50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)配制0.5%碱性品红;(3)25℃条件下孵育30min;(4)5 000r/min离心5 min;(5)B乳清可作为阳性对照的蛋白质样品.该技术为进一步分离鉴定胶乳中橡胶粒子凝集相关蛋白质打下了良好基础.     

一种测定巴西橡胶树胶乳中过氧化氢含量及其在胶乳各组分中分布的方法研究

胶乳活性氧产生与清除失衡是导致橡胶树发生死皮的一个重要因素。由于直接用丙酮提取胶乳中的过氧化氢,存在测定结果重复性不好和准确性不高的问题。笔者在加入丙酮前使用不同提取液对胶乳样品进行预处理,在加入丙酮后使用萃取剂,建立了一种适合测定胶乳中过氧化氢的方法,发现胶乳中的过氧化氢主要分布于C-乳清和黄色体组分,为进一步研究橡胶树乳管活性氧代谢打下良好基础。     

巴西橡胶树乳管细胞中5个橡胶合成关键酶基因节律性表达研究

以巴西橡胶树无性系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的未开割树为材料,采用荧光定量PCR技术,分析乳管细胞中HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5个橡胶生物合成关键酶基因的昼夜表达模式。结果表明：5个基因的表达均具有节律性,而且不同基因在同一无性系中以及同一基因在不同无性系间的节律性表达模式都有一定程度的差异。结果为分析不同环境因素对橡胶生物合成相关酶基因节律性表达的影响具有一定参考价值。     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。