非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,本研究原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的ASFV pK205R蛋白约为44 ku,western blot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、副猪嗜血杆菌及猪大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测灵敏度为1∶2 560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;利用该方法对临床样品检测的结果与国外商品化试剂盒检测结果符合率为100%。本研究建立的ASFV抗体间接ELISA方法为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供技术储备。     

非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA(iELISA)方法,对构建的ASFV P30基因表达工程菌诱导表达后,将获取的重组ASFV P30蛋白进行纯化和Western-blot检测,然后以纯化的重组蛋白为抗原,建立了ASFV抗体iELISA检测方法,并进行了特异性、灵敏性、重复性试验;同时与基于ASFV P30-2His6蛋白(N、C末端各融合1个His6标签)的iELISA方法进行兽医临床样本比较试验。结果显示:重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白在Western-blot检测中,均能与猪ASFV阳性血清产生特异性杂交带;基于重组ASFV P30蛋白iELISA的最佳反应条件为,抗原蛋白包被质量浓度20μg/mL、血清样品稀释度1:1 000、酶标二抗稀释度1:40 000、血清样品检测OD450阳性结果临界值0.22。该方法仅对ASFV阳性血清呈特异性反应,1:3 200稀释的阳性血清仍可检出,批内试验和批间试验变异系数均小于10%,可以消除His标签所造成的假阳性反应。本研究建立的ASFV P30 iELISA检测方法为ASFV抗体检测提供了一种有效手段。     

非洲猪瘟病毒抗体化学发光检测方法的建立与应用

【目的】建立一种特异性强、敏感度高、操作简捷、高通量的非洲猪瘟病毒(African swine fever, ASFV)抗体化学发光检测方法,用于早期监测ASFV的流行情况。【方法】本研究以羧基磁珠作为固相载体偶联ASFV重组p72蛋白,用适量的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭,加入检测样品进行反应,以兔抗猪IgG-AP抗体作为酶标抗体,加入相应底物进行显色,优化各项反应条件,建立ASFV抗体化学发光检测方法,并对该方法的特异性、敏感度、重复性和检出率进行验证。【结果】建立的ASFV抗体化学发光检测方法蛋白与羧基磁珠偶联最适pH为7.0,最佳蛋白偶联浓度为5μg/mL,使用10%BSA溶液封闭效果最佳,反应磁珠终浓度为1.00 mg/mL,酶标二抗最佳工作稀释度为1∶40 000。同时该方法反应时间为30 min,血清稀释度为1∶512,敏感度高于商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒,与猪瘟病毒、A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒gE、猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性标准血清均无交叉反应。重复性试验中,批内变异系数为4.41%～8.70%,...     

A型塞内卡病毒VP2蛋白阻断ELISA检测方法的建立

为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学检测方法,本研究根据ASFV Georgia2007/1株基因组合成其p72全长基因,并将其克隆至p GEX6p-1载体,构建重组质粒pGEX6p-1-p72并经酶切、PCR和测序鉴定正确后转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示获得了可溶性表达且纯度较高的重组p72蛋白(rp72)。利用GST亲和纯化层析柱纯化,得到浓度为0.2 mg/mL的rp72。以rp72作为包被抗原,通过优化各反应条件建立检测猪血清中非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法,结果显示,rp72最佳包被浓度为1.25μg/mL,封闭时间为37℃1 h;待检血清稀释度为1.100,孵育时间为37℃30 min;羊抗猪IgG-HRP孵育时间为37℃1 h。利用该方法检测280份阴性血清,确定其临界值为0.412。采用建立的间接ELISA抗体方法对PEDV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV、PPV、PCV、E. coli阳性猪血清进行检测,结果显示,除ASFV阳性对照为阳性外,其他病原阳性血清检测结果均为阴性,该方法特异性强;将非洲猪瘟抗体阳性猪血清2倍倍比稀释(1.100～1.6 400)后,利用该方法进行检测,结果显示其检测阳性血清的稀释度为1.3 200倍时OD_(450nm)值仍大于临界值,敏感性高于市售西班牙ASFV阻断ELISA试剂盒检测结果,本研究建立的方法敏感性较高;对该方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间的变异系数均10%,重复性良好。利用本研究建立的ASFV ELISA抗体检测方法(p72)对184份临床血清进行检测,结果显示该方法敏感性为100%,特异性为98.70%;与ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒方法总符合率为98.91%,kappa值为0.961。本研究首次基于rp72建立的非洲猪瘟抗体间接ELISA检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为ASFV抗体检测提供了一种快速、精准、经济、高效的方法。     

非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立

以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪血清中非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA方法,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018株基因组为模板优化合成CP204L基因(1 bp～549 bp),构建pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(rP30),以Ni亲和纯化后的rP30作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立了一种快速检测ASFV P30抗体的血清学方法。结果显示,胞外分泌的rP30约为30 ku,western blot鉴定结果显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为0.4μg/mL,待检血清稀释倍数为1.25,血清反应时间为30 min,兔抗猪IgG-HRP稀释度为1.10 000。利用该方法同时检测猪临床常见病毒阳性血清,结果显示建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV感染血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒和猪口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;将ASFV感染血清2倍倍比稀释后,利用本实验建立的ASFV抗体间接ELISA方法、ID.VET(P32)试剂盒和INGENASA(P72)试剂盒同时检测,结果显示本实验建立的方法检测灵敏度为1.128,与INGENANA(P72)试剂盒相同,低于ID.VET(P32)试剂盒(1.1 024);批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性良好。利用该方法与ID.VET试剂盒同时对383份临床样品进行检测,二者符合率为98.9%。本研究建立的方法可为ASF的监测和防控提供技术支持。     

猪流行性腹泻病毒血清IgA抗体间接ELISA方法的建立

建立了检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,旨在为PEDV感染检测与免疫效果评价提供技术手段。以重组PEDV结构蛋白(S1蛋白)作为包被抗原,采用方阵滴定法确定抗原包被浓度、封闭液、稀释液以及待测血清和酶标抗体的最佳工作浓度,建立了PEDV IgA抗体检测间接ELISA方法。进而检测方法的特异性、批内与批间重复性,评价建立方法与国外试剂盒的符合率,分析ELISA检测血清特异性IgA抗体水平与中和抗体的相关性。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,封闭液和抗体稀释液为含5%犊牛血清的PBS,待检血清和酶标抗体的工作浓度分别为1∶40与1∶1 500倍稀释。结果表明,该ELISA能够特异地检测PEDV抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等病毒的抗血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数低于10%,与现有试剂盒的总符合率为94.8%,血清特异性IgA抗体水平与中和抗体呈正相关(r=0.69,P<0.001)。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，利用大肠杆菌表达系统成功表达E2蛋白并纯化，利用纯化后的蛋白作为包被抗原，用方阵法对影响ELISA试验的各个因素进行优化，并进行特异性、敏感性和重复性试验。确定E2抗原最佳包被浓度为1μg/mL,最佳血清稀释度为1∶40,最佳封闭液为1%明胶，最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min;最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD_450nm≥0.255。与血清中和试验和商品化试剂盒进行比较，总符合率分别为98%和96%,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与其它常见牛病毒阳性血清均无交叉反应。本研究成功建立了间接ELISA方法，为进一步用于大批量牛血清样本的抗体检测和流行病学研究奠定了基础。     

基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明¹⁴⁶PAEPYTT¹⁵²为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2 μg·mL^-1),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05% PBST溶液稀释5 000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1 600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。     

基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为：抗原于37 ℃孵育1 h后经4 ℃包被酶标板过夜、于37 ℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37 ℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为：当待检血清的D_{450 nm}值≥0.365时,判定为阳性;当D_{450 nm}值＜0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量（0.110~0.554 mg/mL）;批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%（94/124）和32.26%（40/124）。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法，本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体(MAb)作为检测抗体，采用方正滴定法对反应条件优化后初步建立了检测ASFV的阻断ELISA方法。利用该方法检测133份ASFV阳性血清和73份ASFV阴性血清，通过ROC曲线分析确定临界值。结果显示，该方法的临界值为25.62%时，ROC的曲线面积最大，为0.9989，诊断敏感性和特异性分别为98.63%和98.5%。利用该方法检测ASFV、O型口蹄疫病毒(FMDV)、A型FMDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒阳性血清，结果显示，除ASFV阳性血清外，其他阳性血清均为阴性，表明特异性强；利用该方法和商品化试剂盒对2倍倍比稀释(1∶4～1∶2 048)的两种ASFV灭活阳性血清(P1、P2)检测，结果显示该方法检测结果与商品化试剂盒基本一致，敏感性高。利用该方法对3份灭活的...     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2 000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD₄₅₀≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。     

犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

试验以利用重组弓形虫SAG1基因转染蜥蜴利什曼原虫所表达获得的目的蛋白作为包被抗原,建立了一种快速、特异、可检测犬弓形虫抗体的间接ELISA方法。确定了抗原最佳包被浓度为6.75 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,对已知阳性血清检测的下限可达1∶6400,批间和批内重复性试验的变异系数均小于10%,包被抗原的酶标板在4、-20 ℃环境中可保存8个月以上。建立的间接ELISA方法应用于犬弓形虫抗体的检测具有较好的敏感性及特异性。     

间接ELISA检测犬瘟热血清抗体方法的建立

以重组表达的犬瘟热病毒融合蛋白(fusion protein,F)作为包被抗原,建立了检测犬瘟热病毒血清抗体的间接ELISA方法。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为125ng/孔,血清最佳稀释度为1∶160。经阻断试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性较好,可用于犬瘟热血清抗体的定量和定性检测。     

大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法的建立

旨在建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法。经琼脂糖凝胶层析纯化大豆抗原蛋白,以不同剂量皮下注射免疫小鼠,采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法,利用该方法检测小鼠免疫后血清抗体水平。通过方阵滴定法确定11S蛋白最佳包被浓度为5.0μg/mL,血清稀释倍数为1∶800;7S蛋白抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清稀释倍数为1∶1 600;两者的批内、批间系数均小于10%,重复性较好,通过ELISA法确定11S和7S蛋白的最佳免疫次数为2次,免疫剂量为1 000μg/kg。结果表明本试验初步建立大豆抗原蛋白抗体检测间接ELISA方法,具有很强的特异性、敏感性和重复性,可用于大豆抗原蛋白过敏反应的临床检测。