口蹄疫病毒O型、亚洲I型二价灭活疫苗的研究

对O型口蹄疫病毒OHM/02株和亚洲I型口蹄疫病毒Asia I-KZ/03株进行了部分生物学特性分析,结果表明它们对牛的毒力较强,传代后毒力稳定,OHM/02株半数感染量(ID50)在107.5～108.25/0.2mL,Asia I-KZ/03株半数感染量(ID50)在106.75～107.5/0.2mL之间,适合做检验用毒;同时该2株毒易感染乳鼠,适应BHK21细胞,对乳鼠毒的半数致死量(LD50)OHM/02株毒在107.0～109.0/0.2mL,Asia I-KZ/03株毒在107.0～108.5/0.2mL;通过攻毒保护试验证实,病毒的免疫原性良好,制备的细胞毒灭活疫苗均达到3个以上的PD50.通过病毒大规模生产工艺的探索(转瓶培养和悬浮培养)、疫苗佐剂的研究、免疫持续期的监测和安全性等试验,成功研制了口蹄疫病毒O型、亚洲I型二价灭活疫苗,获农业部新兽药注册证书.     

口蹄疫疫苗效检模型动物测毒及口蹄疫种毒冻干试验

应用豚鼠作为口蹄疫疫苗效检模型动物检测口蹄疫病毒对模型动物的病原性.用体重400 g左右的豚鼠,将猪O型口蹄疫灭活疫苗效检攻毒毒株ORMF8经后肢蹠部皮内注射途径进行测毒.测毒结果表明,口蹄疫病毒可引起豚鼠出现典型发病,并产生明显病变,ORMF8种毒对豚鼠的毒价可达105.5ID50/0.2 mL.将乳鼠中和试验用种毒OMⅡ按一定比例加入5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂进行冷冻真空干燥试验,3次冻干试验结果表明,种毒冻干后病毒含量有一定程度的下降,但下降程度不显著.     

猪口蹄疫O型灭活疫苗PD50效检攻毒剂量试验

采用PD50效检方法,对0304041-2批猪口蹄疫O型灭活疫苗(I型苗)进行不同攻毒剂量的PD50 检测.结果表明,分别用500 ID50 、1 000 ID50 、2 000 ID50 和4 000 ID50 的病毒进行攻毒,疫苗每头份分别含5.2、3.6、2.1和1.0个PD50 .该项试验的攻毒毒株ORMF8的ID50为10-7.0/2 mL,MID为10 -6.0 /2 mL.     

采用蚀斑技术克隆纯化口蹄疫病毒的研究

本研究应用BHK₂₁细胞通过蚀斑试验克隆和再次克隆牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒AKT03毒株并对克隆前和第1次、第2次克隆的口蹄疫病毒毒株的细胞半数感染量（TCID₅₀）、乳鼠半数致死量（LD₅₀）进行比较测定,结果表明,通过蚀斑试验成功克隆了牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒AKT03毒株,第1次克隆的毒株和第2次克隆的毒株TCID₅₀和LD₅₀效价明显提高。     

牛O型口蹄疫灭活疫苗效力检验方法的改进

以10000 ID50剂量的乳鼠肌肉毒通过颈部肌肉注射途径攻击牛,取代用牛舌皮强毒在牛舌面涂抹和上唇划痕各1ml的方法,进行了牛O型口蹄疫灭活疫苗效力检验试验。结果对照组牛3/3发病,免疫组牛均100%保护。     

猪口蹄疫O型病毒ORMF8测毒试验

用中国农科院兰州兽医研究所统一提供的猪口蹄疫O型灭活疫苗效检攻毒用种毒ORMF8,在3个企业同时用架子猪进行测毒,分别测得猪的最小感染量(MID)和猪的半数感染量(ID 50).3家单位测得的MID和ID 50分别为10 -6.0 /2 mL,10 -8.2 /2 mL;10 -7.0 /2 mL,10 -7.0 /2 mL;10 -6.0 /2 mL,10 -7.5 /2 mL.将所有实验动物统计计算,MID约为10 -6.3 /2 mL,ID 50约为10 -7.6 /2 mL.从这些数据得出,该试验1 MID约为20 ID 50.     

口蹄疫O-A-Asia Ⅰ型三价灭活疫苗免疫效力和最小免疫剂量的研究

为确定口蹄疫O-A-AsiaⅠ型三价灭活疫苗的安全性和免疫效果，按OIE口蹄疫疫苗效检标准和我国口蹄疫灭活疫苗质量标准，对实验室条件下制备的4批疫苗进行了安全性试验、免疫效力试验、免疫持续期试验、疫苗保存期试验和最小免疫剂量试验。结果显示，4批疫苗均对靶动物和实验动物安全，无任何毒副反应；对O、A、AsiaⅠ型口蹄疫的平均免疫效力分别为4．73、6．84和8．10PD50／头份；一次接种的有效免疫期达6个月；2～8℃下的疫苗保存期为12个月；适宜的免疫剂量为，6月龄以上牛每头3．0mL，6月龄以下牛每头1．5mL。该疫苗对接种动物安全，免疫效果良好，一次接种可同时预防O、A、AsiaⅠ型3个血清型的口蹄疫。     

狂犬病病毒CVS-11株的培养及其效价测定

本研究通过神经瘤细胞（NA）培养CVS-11株狂犬病病毒,并测定不同批次的病毒毒价,为优化狂犬病疫苗的生产工艺提供数据支持,具有实际意义。病毒培养和检测结果表明,第1次和第2次收获的病毒液病毒含量较高,在107.0FFU/0.1 mL以上,毒力为106.4～107.0LD50/0.03 mL;而第3次收获的病毒含量则较低,只有106.0FFU/0.1 mL左右,毒力为105.0～105.3LD50/0.03 mL。第1次和第2次收获的病毒液可用于制备狂犬疫苗,第3次收获的病毒液因毒价较低不适于制备狂犬疫苗。     

猪圆环病毒2型PK15细胞系高敏感性细胞的克隆

利用有限稀释法从现有PK15细胞系中克隆出一株对猪圆环病毒2型具有高敏感性的细胞克隆株PKK,初步研究了该克隆株对猪圆环病毒2型增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光实验结果表明将该克隆株连续传代50代后对猪圆环病毒2型感染性不变,病毒滴度最高可达107.0TCID50/mL。这一研究结果将有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗。     

奶牛口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗免疫效果对比试验

为了解兰州地区奶牛口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的免疫效果,科学评价免疫质量以及合理制定口蹄疫疫苗免疫程序,本研究应用液相阻断ELISA和O型正向间接血凝检测方法分别对目前兰州地区使用的4种口蹄疫二价灭活疫苗的免疫效果进行了对比。结果表明,兰州地区使用的4种口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的O型和亚洲Ⅰ型口蹄疫保护性抗体诱导能力参差不齐,其中以B公司O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的抗体诱导能力最强,其他3个公司的疫苗则相对较差。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗效力检验中参考疫苗的应用

制备了4批不同抗原含量的猪圆环病毒2型（PCV2）灭活疫苗,灭活前PCV2病毒含量分别为107.0、106.5、105.5和104.5TCID50/mL。对此4批PCV2灭活疫苗,利用本实验室建立的小白鼠效力检验标准进行效力检验,即以PCV2参考疫苗作为对照品,测定待检疫苗免疫小白鼠后血清中PCV2抗体效价的高低来判定疫苗效力。3次重复检测结果都显示灭活前病毒含量为107.0、106.5和105.5TCID50/mL批次的疫苗合格,而灭活前病毒含量为104.5TCID50/mL批次的疫苗不合格,这与猪体内的效力检验结果一致,表明建立的针对猪圆环病毒2型灭活疫苗的小白鼠效力检验方法具有良好的准确性和重复性。     

禽呼肠孤病毒S1133株的毒力鉴定

将引进的ARV S1133株强毒在SPF鸡胚上传1代,对E2代种毒进行了病毒含量和对雏鸡的毒力测定试验,结果表明,E2代ARV S1133株病毒含量≥105.9EID50/0.2 mL.对3～7周龄雏鸡的半数感染量≥104.16～4.18/0.1 mL,ARVS1133株强毒毒力符合要求,可以作为强毒攻毒株.     

口蹄疫病毒O型OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建

为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)的感染性克隆,采用RT-PCR将O型FMDV OHM/02株全长基因组分为5个重叠的片段进行扩增,克隆至载体pUC57中,获得全长cDNA克隆pPO-1。将线性化的pPO-1与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,出现致细胞病变效应(CPE)。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切、测序,表明人工设计的分子标记Bam HⅠ酶切位点消失,排除了亲本毒株污染的可能性。间接免疫荧光试验可以检测到绿色荧光,电镜观察可观察到病毒粒子,表明构建了具有感染性的OHM/02毒株全长cDNA克隆。病毒生长曲线表明,拯救病毒与亲本病毒的复制能力和增殖特性相似。OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建及拯救可为FMDV致病机理的研究提供一种重要工具,可促进疫苗的研发。     

奶牛AsiaⅠ-O型口蹄疫双价灭活疫苗免疫程序对比试验

本试验分4组进行了AsiaⅠ-O型口蹄疫疫苗免疫效果对比试验,结果表明,AsiaⅠ-O型FMD双价灭活疫苗对奶牛O型口蹄疫免疫效果好,一次免疫180d后还有较高的保护抗体;对奶牛AsiaⅠ型口蹄疫免疫效果差,抗体水平很难维持较高水平和较长时间。首免40d后加强免疫1次,以后每间隔4个月免疫1次,这种免疫程序比较适合衢州地区的奶牛口蹄疫免疫。     

偶蹄动物免疫口蹄疫O型亚洲Ⅰ型二价疫苗后O型和亚洲Ⅰ型免疫抗体监测结果差异的原因分析

偶蹄动物免疫口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗,监测口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型免疫抗体滴度和合格率出现的差异,使兽医监测部门难以出具监测报告,镇动监所无法加强免疫,养殖户对疫苗质量和监测方法提出质疑。面对使用口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价疫苗带来的矛盾和困扰,笔者通过对试验数据的统计和免疫抗体监测结果的分析后发现,不同的偶蹄动物免疫相同的口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗后,由于检测方法不同、检测的血清型不同,导致O型口蹄疫免疫抗体合格率高于亚洲Ⅰ型口蹄疫免疫抗体合格率平均值3.8%。同时将O型正向间接血凝(HA)与液相阻断(LB-ELISA)进行比较,在414份亚洲Ⅰ型口蹄疫免疫抗体检测结果小于农业部标准的样品中,O型口蹄疫免疫抗体大于或等于农业部标准有256份样品,相差61.8%。     

鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗免疫剂量研究

为了确定鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus-Ⅰ,PPMV-Ⅰ)(S-1株)灭活疫苗的免疫剂量。本试验采用3批PPMV-Ⅰ(S-1株)灭活疫苗实验室制品以不同剂量肌肉注射免疫30日龄低抗体幼龄鸽(HI抗体≤2)和120日龄低抗体青年鸽(HI抗体≤2),分别在免疫后第14,28天对试验鸽进行攻毒,对试验鸽进行临床症状、抗体检测和攻毒保护测定。结果显示,该疫苗对低抗体鸽有保护作用,对30日龄幼龄鸽和120日龄青年鸽的最小免疫剂量分别为0.05,0.2mL/只。因此,为了确保疫苗的免疫效果,在PPMV-Ⅰ(S-1株)灭活疫苗制造及检验规程中疫苗用法用量规定:幼龄鸽肌肉注射,0.2mL/只;青年鸽和种鸽肌肉注射,0.5mL/只。     

牛口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型灭活疫苗效力检验豚鼠替代方法的探索

为了探索口蹄疫效力检验的替代方法,用牛口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型灭活疫苗免疫牛和豚鼠各2组,21d后分别攻击口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型强毒,观察记录本动物及替代动物的发病情况,用Reed-muench法计算其PD50值。结果显示,豚鼠的PD50值与牛的PD50值呈一定的正相关。     

口蹄疫疫苗的悬浮培养工艺研究

通过生物反应器中进行BHK21细胞悬浮培养并逐级放大,分别接种口蹄疫OJMS/2000株与Asia 1/JSL株,纯化灭活后制备50批疫苗,结果均符合《口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价疫苗(OJMS株+ JSL株)制造及检验规程》（以下称规程）所规定的各项标准,病毒146S抗原含量比转瓶培养提高10倍以上、疫苗的不良反应得到进一步改善.     

亚洲1型口蹄疫病毒L蛋白缺失株的构建及其生物学定性

为确定口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白缺失对其生物学特性的影响,本研究在已建立的Asia1型FMDV反向遗传操作平台基础上,利用融合PCR方法缺失L蛋白基因编码区,构建了缺失L蛋白的重组Asia1型FMDV(rFMDV-ΔL)。拯救病毒的一步生长曲线结果表明,rFMDV-ΔL与亲本病毒相比在BHK-21细胞中的复制水平下降10倍,乳鼠毒力试验表明rFMDV-ΔL的毒力比亲本毒株下降6倍。另外,rFMDV-ΔL在BHK-21细胞上产生病变的速度明显变慢,形成蚀斑的时间延长,致乳鼠死亡所需时间也比亲本毒株明显延长。本研究是关于亚洲1型FMDVL蛋白结构与功能研究的首次报道,为亚洲1型FMDVL蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

口蹄疫A型油佐剂和leo佐剂弱毒灭活疫苗免疫持续期的研究

用实验室配制的口蹄疫油佐剂和leo佐剂A型弱毒灭活疫苗各免疫6月龄健康敏感牛（乳鼠中和抗体滴度小于1：4）5头，免疫后每月采血一次，分离血清；采用固定病毒稀释血清的方法，通过乳鼠中和试验检测免疫牛血清中的口蹄疫A型中和抗体的产生与消长情况，用karber法计算中和效价，绘制动态曲线图。结果显示，口蹄疫弱毒灭活疫苗免疫牛，可以产生高滴度的血清中和抗体，免疫牛血清中和抗体效价均在免疫后1个月左右达到高峰。油佐剂疫苗免疫的牛，血清中和抗体效价比较高，但下降比较迅速；leo佐剂疫苗免疫的牛，血清中和抗体效价比较低，但下降比较平缓。