布氏杆菌抗独特型抗体苗豚鼠免疫试验

用新研制的抗牛布氏杆菌独特型抗体苗(简称二抗苗)免疫豚鼠并于免疫后4个月进行强毒菌株攻击保护试验表明,3个不同免疫剂量组豚鼠平均保护率为79.1％,血清凝集试验结果表明,免疫豚鼠产生了一定滴度的凝集抗体,这证明该抗独特型抗体苗具有良好的免疫原性。     

布鲁氏菌S19疫苗免疫奶牛血清凝集抗体的动态变化与水解素皮肤变态反应相关分析

观察奶牛在布鲁氏菌S19疫苗免疫状态下血清凝集抗体的动态变化规律和免疫后奶牛对布鲁氏菌水解素的皮肤迟发性变态反应差异,并探索两者的相关性,寻找选择布鲁氏菌病抗性牛的方法。选择布病阴性的性成熟青年黑白花奶牛50头,注射S19疫苗1×109CFU/头,定期采集血液测抗体水平,第60天用布鲁氏菌水解素皮内注射,检测变态反应。结果显示,所有免疫牛均能在15天时检测到凝集抗体,30天达到峰值。迟发性变态反应表明,免疫牛对布鲁氏菌水解素具有良好的敏感性,变态反应强度与抗体峰值水平存在相关性,但差异不显著,相关系数为0.235。     

团头鲂细菌性败血症免疫研究

将温和气单胞菌(Aeromonas sobria)复壮,在28℃条件下加福尔马林灭活48 h,制备成灭活苗.用该疫苗免疫团头鲂,取免疫后第10 d,20 d,30 d的血清做凝集抗体试验,最高凝集抗体效价达1∶32～128,对照组为1∶4～8;免疫鱼的抗感染保护力达70%.     

中华鳖细菌性疾病免疫防治的研究

将分离自中华鳖主要细菌性疾病如肠道出血性败血症、鳖穿孔病(疖疮病)、红脖子红底板病、鳖腐皮病的四株病原菌,在3.5%福尔马林溶液中24 h全部灭活;经灭活的四株菌加入Al(OH)₃胶,制成总含菌量为6×109／mL的四价菌苗。小白鼠注射疫苗后21～35 d,对这四株菌的血清凝集抗体效价最高达29,免疫保护率达100%,且对四株菌均有保护作用。鳖免疫后15 d就产生抗体,血清中凝集抗体效价高达27,免疫保护率达100%,对四株菌均有保护作用;同时开展鳖生产性免疫预防试验,鳖存活率有较大提高,免疫池鳖发病死亡率平均下降50%,有效地防治了养殖鳖病害。     

三种血清学布鲁氏菌检测方法在不同疫苗免疫奶牛中的比较

布鲁氏菌病是一种世界范围内广泛分布的严重人畜共患病。疫苗免疫和血清学诊断是有效控制和净化该病的两种重要措施,但疫苗免疫对血清学诊断存在较大影响。因此,弄清楚不同疫苗免疫在不同检测方法下的抗体消减规律显得尤为重要。本研究选取15头6月龄健康母牛,随机分为5个试验组,每组3头,分别为600亿单位A19疫苗注射组、600亿单位A19疫苗口服组、500亿单位S2疫苗口服组、500亿单位S2疫苗注射组和对照组。对不同组试验牛进行隔离饲养,免疫完成后进行一次带牛环境消毒。免疫完成后每月采集牛血制备血清保存,连续采集6个月,分别使用RBPT(虎红平板凝集实验)、iELISA、cELISA进行检测。结果表明,相比口服免疫方式,注射免疫方式的疫苗抗体峰值水平更高,抗体持续时间更长;注射免疫方式下,S2疫苗的抗体峰值水平高于A19苗,但抗体持续时间较短;口服免疫A19疫苗,6个月内三种方法均未检测到抗体。可见,疫苗免疫对布鲁氏菌病血清学诊断有明显的干扰作用,但对cELISA检测的影响时间较短,采用cELISA可有效区分疫苗免疫和野毒感染。针对不同免疫方式的不同疫苗,应选择合适的时间节点。     

牛轮状病毒灭活疫苗的免疫原性研究

制备了牛轮状病毒甲醛灭活疫苗,以小鼠和兔子为模型检测其免疫原性。将本室分离鉴定的牛轮状病毒野毒株（CHLY株）在恒河猴肾细胞系（MA-104）上增殖,制备病毒抗原液。当病毒的感染力达到10^6 TCID50／mL以上时,甲醛灭活,并分别制备油乳佐剂疫苗和铝胶佐剂疫苗,然后免疫试验动物,检测疫苗的免疫原性。小鼠免疫试验结果表明,第2次免疫后所有免疫组均产生了高水平IgC抗体,与对照组差异极显著（P〈0．01）,油乳佐剂疫苗与铝胶佐剂疫苗免疫效果差异不显著（P〉0．05）;兔免疫试验中,免疫组母兔产下仔兔血清中含有高水平的牛轮状病毒特异性抗体,与对照组差异极显著（P〈0．01）。试验表明制备的牛轮状病毒甲醛灭活疫苗具有较好的免疫原性,免疫后可显著提高体内特异性抗体水平。     

禽霍乱强化苗研究——Ⅱ.与国外同类苗免疫比较

本试验将研制的禽霍乱强化苗与Intervet疫苗进行免疫比较试验。结果表明强化苗在免疫早期抗体产生时间优于Intervet疫苗。免疫1个月后,两种疫苗试管凝集抗体效价曲线无明显差异,免疫期均达6个月。两种疫苗1至6个月的攻毒保护率分别为94. 4％和86. 7％。两种疫苗免疫接种产蛋鸡后2周内,分别使免疫鸡的平均日产蛋量下降2.6％和6.5％、以上试验表明,本课题组研制的禽霍乱强化苗在免疫性方面已经达到或部分指标已超过国际同类先进产品的水平。     

禽霍乱强化苗研究：Ⅱ.与国外同类苗免疫比较

本试验将研制的禽霍乱强化苗与Ｉｎｔｅｒｖｅｔ疫功进行免疫比较试验，结果表明强化苗在免疫早期抗体产生优于Ｉｎｔｅｒｖｅｔ疫苗。免疫１个月后，两种疫苗试管凝集抗价曲线无明显差异，免疫期均达６个月。两种疫苗１至６个月的攻毒保护率分别为９４．４％和８６．７％，两种疫苗免疫接种产蛋鸡后２周内，分别使免疫鸡的平均日产蛋量下降２．６％和６．５％，以上试验表明，本课题组研制的禽霍乱强化苗在免疫性方面已经达到或部分     

己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备

以己烯雌酚(DES)、琥珀酸酐和牛血清白蛋白(BSA)等为主要原料,采用混合酸酐反应(氯甲酸异丁酯法)将半抗原己烯雌酚与载体蛋白BSA联接制备成人工免疫原。用此免疫原免疫家兔,并以间接ELISA法测定抗体效价。结果表明,人工合成的抗原具有很强的免疫原性,被免疫兔血清中的抗DES抗体效价高达28。本试验为下一步制备抗DES单克隆抗体及研制快速检测DES残留的免疫试剂盒奠定了基础。     

雏鸡感染传染性法氏囊病病毒后对新城疫疫苗的免疫反应

本文对人工感染传染性法氏囊病病毒(IBDV)雏鸡接种新城疫(ND)疫苗后的红细胞凝集抑制(Hi)抗体滴度和免疫保护力进行了检测。结果表明,人工感染IBDV雏鸡一次接种ND疫苗后的Hi抗体滴度和免疫保护力,明显低于未感染IBDV的对照雏鸡;人工感染IBDV雏鸡二次接种ND疫苗后的Hi抗体滴度和免疫保护力,比一次接种ND疫苗时明显升高。     

牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体,利用纯化蛋白作为包被抗原,建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法（iELISA）。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因,将目的基因克隆入PEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-Virb8,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,利用所建立的iELISA方法对235个临床奶牛血清样本进行检测,并与虎红平板凝集实验进行比较。【结果】成功构建了含Virb8的表达载体,经多次对表达条件的优化,大量表达了目的蛋白,建立的iELISA方法具有稳定、灵敏的特点,与虎红平板凝集试验的符合率可达97.02%。【结论】所建立的iELISA方法是一种有效的牛布鲁氏菌病血清学诊断的方法,为进一步研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。     

Blue-light-activated histidine kinases: two-component sensors in bacteria

Histidine kinases, used for environmental sensing by bacterial two-component systems, are involved in regulation of bacterial gene expression, chemotaxis, phototaxis, and virulence. Flavin-containing domains function as light-sensory modules in plant and algal phototropins and in fungal blue-light receptors. We have discovered that the prokaryotes Brucella melitensis, Brucella abortus, Erythrobacter litoralis, and Pseudomonas syringae contain light-activated histidine kinases that bind a flavin chromophore and undergo photochemistry indicative of cysteinyl-flavin adduct formation. Infection of macrophages by B. abortus was stimulated by light in the wild type but was limited in photochemically inactive and null mutants, indicating that the flavin-containing histidine kinase functions as a photoreceptor regulating B. abortus virulence.     

一株中等毒力牛种布鲁氏菌的鉴定和毒力测定

【目的】对初步鉴定的牛种布鲁氏菌分离株（B. abortus 343）进行全面的生物学特性检定,为深入研究布鲁氏菌病提供参考菌株。【方法】将B. abortus 343划线培养及梯度稀释,使其形成单个菌落,观察菌落形态。挑取单个菌落进行革兰氏染色和柯氏染色,观察其染色特点;分别接种1.5×106 CFU到含硫瑾（1﹕25 000）或含碱性复红（1﹕25 000）的TSA平板上,观察其生长状态;将接种有B. abortus 343的TSA平板分别置于普通培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO2的依赖性;通过醋酸铅试纸条测定B. abortus 343代谢过程中是否释放H2S。通过平板凝集试验测定布鲁氏菌单相特异性血清（ 牛种布鲁氏菌单因子血清A、羊种布鲁氏菌单因子血清M 和 布鲁氏菌粗糙型血清R ）与B. abortus 343抗原的反应性;利用布鲁氏菌AMOS-PCR种属分型等方法对B. abortus 343进行了PCR种属特性鉴定;将B. abortus 343免疫小鼠,分别测定其抗血清与光滑型和粗糙型抗原的反应性;通过小鼠和豚鼠感染试验,全面评价该分离株的毒力;分别以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,测定B. abortus 343在小鼠体内存活时间;以1×109 CFU感染Hartley豚鼠,2周后测定试验豚鼠每克脾脏含菌量;分别以10 000、1 000、100、25 CFU/只4种不同剂量感染豚鼠,初步测定分离株对豚鼠的最小感染量（MID）,在此基础上,进一步以40、60和90 CFU/只测定MID。【结果】分离株B. abortus 343 为光滑型牛种布鲁氏菌,菌落逆光观察微带蓝绿色乳光;革兰氏染色为阴性,柯氏染色为红色,H2S试验阳性。该菌能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长,不依赖于CO2。B. abortus 343抗原能与A因子血清呈明显凝集反应,免疫小鼠后能产生特异性抗体。以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,可在小鼠体内存活29周;以1×109 CFU感染350-400 g雌性豚鼠,14 d后豚鼠每克脾脏含菌量2.4×105-1.2×106;以1×105 CFU感染豚鼠1个月后,所有试验豚鼠均能产生特异性光滑型抗体,试管凝集效价为320-1 280;B. abortus 343对豚鼠的最小感染量约为40 CFU。【结论】鉴定了一株中等毒力牛种布鲁氏菌（B. abortus 343）,为深入研究布鲁氏菌病提供了参考菌株,丰富了布鲁氏菌菌种资源。     

Inheritance of an insecticidal gene (cry1Ab) in genetically modified cotton

The present study was conducted to evaluate inheritance pattern of insecticidal gene (Cry1Ab) in F₁ and F₂ generations derived from six combinations of crosses made between two transgenic lines (CEMB-3 and CEMB-11) and two non transgenic lines (MNH-93 and CIM-482). PCR, southern blot, western dot blot assay and lab biotoxicity assay were used to confirm the gene integration and expression of insecticidal gene in successive generations. The insecticidal gene was stably integrated in the genome of all F₁ plants showing the dominant nature of introduced gene (cry1Ab). Furthermore, heterosis, heterobeltiosis, heritability and genetic advance studies of Bt gene were also conducted. Heterosis and heterobeltiosis were estimated for five characters i.e. cotton yield per plant, no. of bolls per plant, boll weight, ginning out turn % age and laboratory bioassay results. The heterosis and heterobeltiosis ranged from??15.19 to 107.07% and 18.58 to 98.79%, respectively for yield per plant; from ?20.34 to 81.36% and ?20.34 to 81.36%, respectively for number of bolls per plant; from -6.96 to 21.38% and ?9.30 to 9.99%, respectively for boll weight; from 13.02 to 26.44% and ?0.52 to 26.17%, respectively for ginning outturn; and from ?8.11 to 36.23% and ?5.56 to 23.68%, respectively for mortality % age of Heliothis larvae in laboratory bioassays. The Broad Sense Heritability and Genetic Advance for insect resistance in Bt versus non-Bt crosses were calculated. Both of these were high in four out of six hybrids. Our data recorded showed that these transgenic lines are an excellent source of germplasm to be used in conventional breeding programme.     

动物布鲁氏菌病疫苗的来历及亚单位疫苗的研究概况

布鲁氏菌病是一种严重危害人和动物健康的人畜共患病,人群感染主要来源于感染的动物及被污染的畜产品,目前疫苗免疫仍是控制动物布鲁氏菌病的主要措施。现有国际参考疫苗主要有牛种疫苗株S19和羊种疫苗株Rev.1,这些疫苗为动物群布鲁氏菌病控制提供重要保障的同时也存在关键的技术瓶颈问题,如安全性差,接种动物出现流产;血清抗体体内持续时间较长,干扰常规诊断等。随着布鲁氏菌基因组测序工作的相继完成及DNA重组技术的发展,新型布鲁氏菌病疫苗的开发成为研究的热点。亚单位疫苗本着其较高的安全性和有效性,在动物群布鲁氏菌病控制过程中具有较大的应用前景。笔者综述了布鲁氏菌病疫苗的发展史,并对布鲁氏菌病亚单位疫苗的研究进展进行概述。     

流产布鲁氏菌BCSP31基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

设计1对引物,突变除去布鲁氏菌BCSP31(细胞表面蛋白31)基因的N端信号肽氨基酸序列,经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL21(DE3)感受态细胞。酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性克隆,测序证明其阅读框完全正确。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,对产物进行SDS-PAGE和Western-blotting检测,发现表达产物出现预期分子量57 kD的融合蛋白,该蛋白能与牛流产布鲁氏菌阳性血清发生反应,进一步证明目的蛋白主要以可溶性形式存在,表达量约占总蛋白的40%,应用GST琼脂糖凝胶FF纯化可得到纯度较高的表达产物。     

流产布氏杆菌病的发病机制

牛布鲁氏菌病是一种非常重要的世界流行的动物传染病。在发展中国家流行范围广,经济损失严重。该病的病原是一种革兰氏阴性球杆菌,能够引起怀孕母牛胎盘坏死及间质性乳腺炎,新生小牛多患有纤维素性肺炎。就流产布鲁氏菌的致病性、对吞噬细胞和非吞噬细胞的侵袭力、在胞内的生存机制及阻碍吞噬细小体-溶酶体的粘附进行综述,尤其对获得性免疫反应如何抵抗布鲁氏菌感染作了重要的阐述。     

Construction of an engineering strain expressing cry7Ab7 gene cloned from Bacillus thuringiensis

The genotype of Bacillus thuringiensis (Bt) strain GW6 isolated in China was identified, and a novel cry7Ab gene was found based on the results of PCRs using 40 pairs of cry universal primers. The cry7Ab gene was cloned by PCR and named as cry7Ab7 by the Bt Delta Endotoxin Nomenclature Committee (GenBank Accession No. FJ940776). The construction of a novel three-dimensional structure of Cry7Ab7 protein via homology modeling methods indicated that the Cry7Ab7 protein was different from other Cry7Ab proteins within the domain structures. The cry7Ab7 gene was inserted into the BamHI/SalI sites of E. coli expression vector pET21b and the Bt-E. coli shuttle vector pSXY422b to construct the recombinant plasmids pET21b-7Ab7 and pSXY422b-7Ab7, which were then transformed into E. coli BL21 and Bt HD73cry in order to obtain the E. coli transformant EC7Ab7 and the engineering strain Bt HD7AB, respectively. The bioassay results showed that Cry7Ab7 protein inclusion bodies in EC7Ab7 and the crystal proteins in HD7AB were highly toxic to the second-instar larvae of Henosepilachna vigintioctomaculata with the LC₅₀ values of 1.167 μg·μL^?1 and 0.779 μg·μL^?1, respectively. Our results clearly indicated that cry7Ab7 gene can offer important benefits to research on Coccinellidae insect pest control.     

布鲁氏菌外膜蛋白BP26细胞毒性作用的研究

【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株,用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞,观察细胞形态变化,ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】 从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得纯化的BP26蛋白,经SDS-PAGE验证正确,Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp26基因的上下臂插入到自杀载体pGEM-7zf中,电转至布鲁氏菌疫苗株M5-90感受态细胞中,成功筛选出了具有遗传稳定性的bp26基因缺失株。用BP26蛋白与bp26基因缺失株分别侵染HPT-8层细胞,BP26蛋白使细胞变形且贴壁不牢,缺失株导致细胞大量脱落溶解,ELISA检测蛋白侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组,差异极显著（P＜0.01）, 而细胞因子IL-10的分泌下降。缺失株侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α均高于M5-90对照组,LDH和IL-10均低于M5-90对照组,差异显著（P＜0.05）。【结论】成功获得了布鲁氏菌BP26蛋白和M5-90Δbp26缺失株,BP26蛋白可以引起HPT-8细胞的炎性反应,有细胞毒性作用,bp26基因缺失株对HPT-8细胞有损伤作用,bp26基因在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中起重要作用。     

李始叶螨种群密度估计方法的研究

根据空间格局研究中获得的资料,对李始叶螨Eotetranychus pruni Oudemans种群的抽样技术进行了研究。结果表明:田间随机取样以“Z”字型方式为最佳,最适抽样单位为1个叶片;建立了利用无螨叶率(P₀)估计种群密度(x)的关系式:x=4.2134(-lnP₀)^1.2729(r=0.979);提出了李始叶螨种群的理论抽样数模型、序贯抽样模型和用于指导防治的序贯抽样模型。确立了二阶抽样技术中所抽取的树数(l)与叶片数(k)的配额公式为:kl=(tcv)²·(9.1138km^-0.9546+5.5412m^-0.4248)