拟南芥Ran2基因超表达和RNAi载体的构建

根据编码拟南芥小GTP结合蛋白的Ran2基因cDNA全序列设计超表达引物和序列内部第397-610bp之间序列设计RNAi引物,以pMD18-T-Ran2为模板,用PCR方法分别扩增出666bp和214bp的片段,分别连接至双元表达载体和RNAi载体上,得到了植物超表达载体pBI-Ran2和RNAi载体Hellsgate2-Ran2,并用电转化法导入农杆菌GV3101菌株中,PCR扩增结果表明所构建的植物超表达载体pBI-Ran2和RNAi载体Hellsgate2-Ran2已导入农杆菌。     

同步抑制棉籽 FAD2 1 与FatB基因表达的RNAi载体构建

采用PCR技术,分别扩增获得靶标基因 FAD2 1 与FatB的功能区域片段426与501 bp,通过PCR引物引入特定的酶切位点,采用DNA标准重组技术与Gateway技术相结合的方法,以表达载体pBI121及RNA干扰载体pANDA35HK为基础,利用种子特异性启动子,成功构建出棉籽特异抑制双基因表达的RNAi载体。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

拟南芥PhrIP1基因超表达、GFP和RNAi载体的构建

根据编码拟南芥成膜素相关蛋白(PhrIP1)基因cDNA全序列设计超表达引物,以1～1000bp之间序列设计GFP引物和序列内部第24～240bp之间序列设计RNAi引物,以pMD18-T-PhrIP1为模板,用PCR方法分别扩增出1.8kb、1.0kb和0.216kb的片段,分别克隆至双元表达载体、GFP载体和RNAi载体上,得到了植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1。用电转化法,将这些重组质粒导入农杆菌GV3101菌株中,PCR扩增结果表明所构建的植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP融合载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1已导入农杆菌。     

水苏糖合成酶基因重组载体的构建及转化农杆菌

以黄瓜叶片中提取的总RNA为模板,经PCR扩增得到长度为1 275bp的基因片断,经过酶切测序之后,将目的基因连接到表达载体,构建成重组质粒。再利用液氮冻融法将表达载体转化农杆菌感受态。     

蚯蚓纤溶酶基因番茄表达载体的构建

为研究蚯蚓纤溶酶的番茄表达,构建EFE基因的番茄表达载体pF和pEF,并导入农杆菌。采用PCR法在EFE基因DNA序列上添加了表达调控元件和酶切位点后,得到新EFE基因片段,将该片段与切去GUS基因的pBI121载体相连,以构建CaMV35S驱动的EFE组成型表达载体pF;用PCR克隆得到的E8启动子片段替换pF上的35S启动子,以构建番茄成熟果实特异性表达载体pEF;最后,采用三亲交配法用重组质粒转化根癌农杆菌EHA105;结果表明:经过酶切、PCR和测序鉴定,EFE基因、E8启动子序列已重组到表达载体上,植物表达载体构建正确,并且已经转化进农杆菌EHA105中。     

新疆卡拉库尔羊Fas基因原核表达载体的构建及表达

根据GenBank的羊Fas细胞凋亡因子序列设计1对特异性引物，将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点引入到引物两端，同时加上保护性碱基。利用RT-PCR技术，从新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总RNA中扩增出特异性基因片段。将分离纯化后的PCR产物与pMD-18T载体进行连接，利用双酶切反应与菌液PCR对阳性重组克隆进行鉴定筛选，然后进行序列测定。使用原核表达载体pET28a来完成Fas的定向克隆，成功构建重组融合表达质粒pET-28a-Fas，然后将质粒转化至E.coli BL21感受态，设置不同IPTG浓度和诱导温度，选择最佳的表达条件，然后初步纯化重组融合蛋白。结果表明，在pET28a表达载体中，Fas基因的插入方向和读码框均正确；同时Fas基因也完成在E.coli BL21融合表达的目的，融合蛋白分子质量为39.7 ku。     

芸薹属查尔酮合酶基因家族RNA干扰载体的构建

采用PCR法克隆芸薹属CHS基因家族的RNAi片段,经T-载体克隆并测序后,用特定的双酶切方案将其反义片段、正义片段分别亚克隆到平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成RNAi载体,转化大肠杆菌,完成复合PCR鉴定,然后转化根癌农杆菌。结果表明:经测序,以甘蓝型油菜BnCHS1基因为模板克隆的芸薹属CHS基因家族的RNAi片段BCHSI为831 bp,采用Nco+Aat和BamH+Xba分别将其反义和正义片段亚克隆到pFGC5941M中;经复合PCR鉴定,11 814 bp的RNAi载体pFGC 5941M-BCHSI(简称pBCHSI)构建成功,并获得了根癌农杆菌LBA4404的工程菌株。芸薹属CHS基因家族RNAi载体的成功构建,将促进甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种类黄酮性状的研究与修饰。     

丹参C4H基因pET32a原核表达载体的构建

【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因（SmC4H）的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32a连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western Blot分析。【结果】克隆得到了1 200 bp大小的基因片段,经测序鉴定其为SmC4H基因片段;连接表达载体测序结果表明,SmC4H-pET32a构建成功,其诱导表达蛋白经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,重组蛋白表达效果较好,且主要以包涵体形式存在。【结论】成功构建了SmC4H-pET32a原核表达载体,并成功诱导了SmC4H-pET32a重组蛋白的表达。     

甘蓝抗枯萎病基因FOC1植物表达载体构建及遗传转化

为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化法对感病甘蓝进行遗传转化,利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。结果表明,最终成功构建FOC1基因的过表达载体pBI121-35S-FOC1,并已成功整合到受体甘蓝基因组中。     

西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

叶用莴苣LsHsp70-3701基因过表达载体的构建及遗传转化体系的优化

为研究叶用莴苣中Hsp70基因的功能,以提高其耐热性,构建LsHsp70-3701过表达载体,农杆菌介导法转化叶用莴苣。从叶用莴苣中克隆得到LsHsp70-3701,利用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切LsHsp70-3701和植物表达载体pCAMBIA1304,回收目的片段并连接,经鉴定后获得过表达载体。以‘P-S11'叶用莴苣为转化材料,针对遗传转化关键因素:苗龄、植物激素浓度、预培养时间、侵染液OD值、侵染时间和共培养时间进行优化。试验结果表明最佳转化条件为:苗龄5d的子叶,6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L,KT质量浓度为0.2mg/L,OD600为0.3,预培养2d,侵染10min,共培养2d。     

铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

SEP3(SEPALLATA3)基因是MADS-box家族中的一员,在花器官的形成和发育过程中具有重要作用.为了解SEP3基因在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的成花转变机理,从铁皮石斛转录组序列中获得一个SEP3基因序列,并命名为DoSEP3.预测其编码区长度为354 bp,预测编码117个氨基酸.DoSEP3蛋白相对分子质量13457.87 Da.其不稳定系数为60.53,亲水性的平均值为-0.121,是不稳定的亲水性蛋白,主要在内质网和细胞核中起作用.二级结构主要以α-螺旋为蛋白质最大量的结构元件,跨膜区分析推测DoSEP3蛋白质具有一个跨膜区.进一步的氨基酸比对显示,铁皮石斛DoSEP3蛋白与金钗石斛SEP3蛋白亲缘关系最近,可能具有类似的功能.基于生物信息学分析,利用CRISPR/cas9技术构建铁皮石斛基因敲除载体,并使用农杆菌介导法进行遗传转化,且已获得阳性原球茎,可为后续的SEP3基因表达研究奠定基础.     

海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达载体的构建及拟南芥转化

海岛棉具有优良的纤维品质,TCP蛋白参与细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP5基因pGEM-T Easy-GbTCP5质粒为模板进行PCR扩增,并将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301中,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得转化海岛棉GbTCP5基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥AtMIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP5前体的植物表达载体amiRTCP5-pCAMBIA3301,为深入研究海岛棉GbTCP5基因的生物学功能奠定基础,为研究棉花纤维发育机制提供理论依据。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

转phyA基因玉米新种质的创制

【目的】构建植酸酶基因(phyA)根部特异表达的重组植物表达载体,并利用其创制磷高效利用的玉米新种质.【方法】通过PCR方法从携带phyA的表达载体pCAMBIA3301中扩增出phyA表达元件ZmGLU1P-phyA-Nos,并将其插入到带有耐盐基因的中间载体pCAMBIA1301-BADH上,获得phyA根特异表达的植物表达载体:pCAMBIA1301-ZmGLU1P-phyA-Nos,通过农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,并对再生植株进行分子生物学检测分析.【结果和结论】经PCR检测获得了9株T0代阳性植株;T1代植株的抗盐筛选、PCR检测、Southern杂交检测及RTPCR检测证明了phyA已经整合到玉米基因组中,获得6株T1代阳性植株;T2代植株的RT-PCR及根组织的酶活性测定结果表明,phyA在转基因植株根部大量表达,植酸酶活性平均比对照植株提高了10.9倍,活性最高的达到5.432 U/g.植酸酶基因在转基因植株根部大量特异表达,获得了转phyA的玉米新种质,为创制磷高效利用的玉米新种质、提高玉米的产量奠定了基础.     

新城疫病毒Roakin株HN基因的克隆及真核表达载体的构建

克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体.