重组酶聚合酶扩增技术及其在兔病原检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术是2006年由英国科学家研发的一种核酸恒温扩增技术,它不同于传统的PCR扩增,恒温条件下短时间内实现靶基因大量扩增,具有恒温、快速、便携、灵敏度高、特异性强、操作简单等优点,具有广阔的应用前景。本文综述了RPA技术的原理、反应条件优化、产物检测方式及在兔病原检测中应用,旨在为兔病原检测新技术、新方法的研制提供参考。     

重组酶聚合酶扩增技术及其在牛病原检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是2006年由英国科学家研发的一种核酸恒温扩增技术,它不同于传统的PCR扩增,可在恒温条件下短时间内实现靶基因大量扩增,具有恒温、快速、便携、灵敏度高、特异性强、操作简单等优点,具有广阔的应用前景。本文综述了RPA技术的原理、引物设计与反应条件、产物检测方式及在牛病原检测中的应用等内容,旨在为牛病原检测新技术、新方法的研制提供参考。     

重组酶聚合酶扩增技术及其在猪病毒性腹泻病原基层现场检测中的应用

猪病毒性腹泻是对养猪业危害严重的一类疾病,导致仔猪大量死亡,损失惨重。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种核酸恒温扩增技术,恒温条件下,短时间内实现靶基因大量扩增,可实现病原的现场快速检测,具有广阔的应用前景。文章综述了RPA技术的原理、产物检测方式及在猪病毒性腹泻病原检测中的应用,旨在为猪病毒性腹泻病原的基层现场检测提供参考。     

副鸡禽杆菌LAMP检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了快速特异的检测副鸡禽杆菌的方法。利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0,针对副鸡禽杆菌16SRNA基因序列设计两组LAMP引物,并对副鸡禽杆菌特异性DNA的扩增条件进行优化,评价所建立LAMP的特异性和灵敏性。结果显示,优化后的反应条件为65℃恒温反应60min,内引物1.60pmol/μL、外引物0.20pmol/μL。该LAMP对13株副鸡禽杆菌均发生了扩增反应,而对大肠埃希菌、禽多杀性巴氏杆菌、空肠弯曲杆菌等14株其他病原微生物没有扩增反应;该LAMP最低检出量为0.17pg/反应,敏感性远高于常规PCR的56pg/反应。结果表明,所建立的副鸡禽杆菌LAMP具有快速、高效、方便操作等特点,适用于基层兽医部门进行副鸡禽杆菌的快速检测。     

重组酶聚合酶扩增技术及其在病毒性猪病快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术是近年来建立起的一种新的核酸恒温扩增技术,具有操作简单、灵敏度高、特异性强、可在短时间内快速扩增出目的片段等优点,在动物疾病早期诊断、现地检测、进出口快速检疫等方面具有良好的应用前景。通过综述RPA技术及其在病毒性猪病快速检测中的最新应用研究进展,以期为更好地防控猪病提供参考。     

重组酶聚合酶扩增技术及其在病毒性猪病快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是近年来建立起来的一种新的核酸恒温扩增技术,具有操作简单、灵敏度高、特异性强、在短时间内快速扩增出目的片段等优点,在动物疾病早期诊断、现地检测、进出口快速检疫等方面具有良好的应用前景。文章综述了RPA技术及其在病毒性猪病快速检测中的最新应用研究进展,以期为更好地防控猪病提供参考。     

环介导恒温扩增技术在动物病原检测中的应用

环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种新型核酸扩增技术,是依赖于靶目标上6个区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶Bst的作用,在60 ℃～65 ℃恒温条件下1 h之内即可完成的基因扩增技术.该技术虽然起步较晚,但发展迅速,目前在很多领域的研究和应用已经取得很大进展.论文从技术原理、引物设计、反应机制和特点等方面了介绍了环介导恒温扩增技术,并就该技术在动物细菌性病原微生物、病毒和寄生虫检测中的应用做了介绍.     

禽呼肠孤病毒与禽白血病病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)、禽白血病病毒(ALV)基因序列,设计2对引物,在建立鉴别各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立2种病毒的双重RT-PCR。对同一样品中的ARV、ALV核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增ARV 485 bp、ALV 673 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的ARV模板。用31份临床病料对本研究双重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这2种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

环介导等温扩增技术及其在病原检测中的应用

近年来,环介导等温扩增技术已经被开发利用.它采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件(60℃～65℃)下,不到1 h的时间里进行核酸扩增,其扩增效率可达到109～1010个数量级,具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点.环介导等温扩增法已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫).论文就环介导等温扩增法的原理、特点及其在动物病原快速检测中的应用等做了简要的综述.     

禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速检测方法的建立

为了建立一种快速、灵敏、简便的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)现场检测方法,本试验将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25～45℃恒温反应15 min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本试验建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测,为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

鸡传染性喉气管炎病毒RPA-LFD检测方法的建立

为建立一种简便、快捷的现地检测鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的方法,本研究联合重组酶聚合酶扩增(RPA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在优选的RPA上、下游引物的5'端分别进行异硫氰酸荧光素和生物素标记,通过引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化建立了一种可以用于ILTV现地检测的RPA-LFD方法。该检测方法在30℃～42.5℃恒温反应20 min即可实现对ILTV目的基因片段的有效扩增;与其它常见禽病病原DNA无交叉反应;RPA扩增产物直接用胶体金侧向流免疫层析试纸条肉眼观察,最低检测限为100拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高100倍。结果表明,本研究建立的RPA-LFD检测方法灵敏度高,操作方便,可用于ILTV的临床快速检测。     

PCR技术在禽病诊断中应用的研究进展

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR),又称体外基因扩增技术,是80年代中期由Mullis.发明的一种新的分子生物学技术,与传统的检测方法如生物化学、细菌学、病毒学和血清学方法等相比较,PCR方法具有特异性和敏感性高、操作简便、快速高效等特点,而且应用广泛。在病原方面,它既可作病原体的检测,也可同时进行不同病原或同一病原不同株的检测。特别适合难以培养的病毒和细菌的检测。经过近20年的发展,目前已开发出多种PCR技术,以适应不同试验需要,现综述PCR技术在禽病诊断中的应用。1PCR原理PCR是由三个基本反应组成的反复循…     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

应用聚合酶链反应检测禽多杀性巴氏杆菌的研究

根据基因库中禽巴氏杆菌病原的基因序列（U51470）,设计了一对跨幅为488bp的引物,并用这对引物对11个不同血清型的禽巴氏杆菌标准株、9株地方分离株和5株哺孔动物巴氏杆菌菌株及其它6种禽病病原进行了PCR扩增,结果11个血清型的禽源巴氏杆菌和9株禽巴氏杆菌地方分离株均得到了片段大小与实验设计相一致的PCR扩增产物,而对5个血清型的哺乳动物巴氏杆菌和其它6种禽病病原的扩增结果为阴性。该PCR能检出10pg的禽巴氏杆菌DNA模板。     

恒温扩增技术在动物疫病检测中的应用

恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有:滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点:恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。     

禽呼肠病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

根据禽呼肠病毒(ARV)的S1基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,用Bst DNA聚合酶,在63.5℃恒温条件下进行扩增,扩增后加入SYBR GreenⅠ染料直接或在紫外灯下观察判定扩增结果。该方法可检测出ARV标准株和分离株,具有很好的特异性;最低能检测出1个拷贝的pMD18-T-S1阳性质粒,敏感性很高。该方法无需特殊仪器,简便,快速,适用于禽呼肠病毒的临床快速检测。     

LAMP技术应用于禽病诊断的研究进展

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新的核酸扩增技术,具有简单、快速、特异性强的特点.由于采用4个引物,与传统的核酸扩增技术相比,它具有敏感、特异的特点.为此,对近几年应用LAMP技术诊断禽流感、禽腺病毒感染、鸭疫、鹅细小病毒病等7种禽病的研究进行了综述.     

重组酶聚合酶等温扩增和重组酶介导扩增技术在兽医领域的应用

近年来,随着畜牧兽医行业的发展和人民卫生水平的提高,核酸检测起着越来越重要的作用,即时检测在兽医实践中的需求十分迫切。重组酶聚合酶等温扩增（RPA）和重组酶介导扩增技术（RAA）是近年发展起来的核酸恒温扩增技术,可与侧向流层析等多种技术相结合,实现恒定温度下的快速检测。相对于PCR等传统方法,RPA和RAA具有操作简单快速、不易交叉污染、不需要大型仪器、结果判定简单明确、利于基层应用的优点,因而在兽医领域得到了广泛应用。该文对RPA和RAA技术的发展和在兽医领域的应用进行了综述。     

PCR结合变性高效液相色谱法与荧光定量PCR法在检测禽白血病中的比较与应用

本研究旨在比较PCR结合变性高效液相色谱技术(PCR-DHPLC)与荧光定量PCR(Real-time PCR)两种方法在检测禽白血病中的应用。根据禽白血病pol基因序列,设计1对引物和1条探针,利用引物进行禽白血病模板的RT-PCR扩增,产物经变性高效液相色谱上样处理;利用引物及探针进行荧光定量PCR扩增,结果与PCR-DHPLC进行比对。两种方法同时用正常鸡胚尿囊液、鸭瘟病毒、传染性支气管炎病毒、鹅细小病毒、H5N1亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒做特异性检测;以稀释成不同梯度的AV228毒株核酸做敏感性检测。试验结果表明PCR-DHPLC方法只对禽白血病病原有阳性扩增的吸收峰,Real-time PCR也只对禽白血病病原有阳性扩增,两法均对其他禽源病毒核酸无特异性扩增;PCR-DHPLC与Real-time PCR法相比,灵敏度虽低于Real-time PCR 1个数量级,但检测限仍可达到3 pg核酸模板。两种方法均能检测到感染鸡的泄殖腔拭子所采集的病毒量。采集120份蛋鸡棉拭子同时进行临床检测,两种方法检测ALV的符合率为100%(15/120)。研究表明两种方法均可用于诊断禽白血病病毒。