甲型H1N1流感病毒致病机理研究进展

本世纪首次暴发的甲型H1N1流感大流行,严重威胁了人和动物的健康,是其继1918年对全球进行疯狂肆虐之后的又一次严重打击.甲型H1N1流感病毒的主要蛋白结构包括血凝素蛋白(HA)、神经氨酸酶蛋白(NA)、聚合酶复合体(PB1、PB2和PA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1、M2)及非结构蛋白(NS1、NS2)等.目前研...     

猪源新型甲型H1N1流感病毒的分离鉴定及遗传进化特点

本研究旨在了解猪源新型甲型H1N1流感病毒山东分离株的遗传进化特点。对山东地区出现的疑似H1N1流感病死猪进行病料采样,然后进行病毒的分离鉴定,并对分离病毒株(A/swine/Shandong/07/2011)的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、NS和M基因进行遗传进化分析。结果显示,该株病毒8个片段的核酸序列与A/H1N1(2009)对应序列的相似性都大于99%,并且该毒株HA蛋白的裂解位点和优先识别唾液酸α-2,6受体的位点与A/H1N1(2009)也高度一致,分别为PSIQSR↓GLFGAI和190D、225D。但是,与A/H1N1(2009)毒株的HA蛋白相比,受体结合位点处出现了重要的突变(Q226R)。该研究结果为进一步研究猪源新型甲型H1N1流感病毒的分子进化提供了重要信息。     

马流感A/马/京防/74-1(H7N7)毒株HA基因的序列分析

流感病毒(Influenza Virus)根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种表面抗原蛋白分为不同的亚型,马流感I型(H7N7)和Ⅱ型(H3N8)是其中比较重要的两个亚型.本研究应用无特定病原体(SPF)鸡胚增殖马流感病毒A/马/京防/74-1(H7N7)毒株,TRIzol LS Reagent提取病毒RNA,RT-PCR扩增HA基因全片段,克隆到PMD18-T载体上,并进行了鉴定和序列测定.所获得的HA基因片段长1 727 bp,编码563个氨基酸残基.根据推导的氨基酸序列进行预测,有7个潜在的糖基化位点和16个半胱氨酸残基,通过序列分析推断,A/马/京防/74-1(H7N7)株病毒的HA来源于禽类,是一株通过基因重排出现的重组病毒.     

甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

本试验旨在构建甲型H7N9流感病毒非结构蛋白（NS1）真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的NS1蛋白。首先提取安徽分离株甲型H7N9流感病毒（A/Anhui/3/2013(H7N9)）的总RNA,通过RT-PCR技术获得了甲型H7N9流感病毒H7N9 NS1全长基因,然后将其克隆至载体pcDNA4-Flag-HA中构建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒pcDNA4-Flag-HA-NS1转染到293T细胞中,通过Western blotting鉴定NS1蛋白的表达。结果表明成功克隆了NS1全长基因,构建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载pcDNA4-Flag-HA-NS1,并在293T细胞中转染表达,Western blotting确定了NS1蛋白的成功表达。该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达NS1蛋白,为后期开展流感病毒NS1蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。     

猪流感病毒H1N1亚型天津分离株核蛋白、基质蛋白、非结构蛋白基因克隆与序列分析

从天津地区不同猪场分离到6株H1N1亚型猪源流感病毒（SIV）。根据GenBank发表的H1N1亚型 SIV的核蛋白（NP）、基质蛋白（M）及非结构蛋白（NS）基因序列,分别设计3对引物,将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行测序分析。遗传进化分析结果表明：A/swine/Tianjin/TJ2/2005（H1N1）与A/swine/Tianjin/TJ4/2006（H1N1）的NP、M及NS基因核苷酸序列在遗传进化树中均与A/swine/Guangdong/33/2006（H1N1）位于同一分支上,属于古典型H1N1猪谱系;A/swine/Tianjin/TJ3/2006（H1N1）与A/swine/Tianjin/TJ8/2006（H1N1)的NP、M及NS基因核苷酸在遗传进化树中均与A/Dunedin/2/2000（H1N1）组成一个大分支,可能起源于人谱系;A/swine/Tianjin/TJ6/2009（H1N1）与A/swine/Tianjin/TJ7/2009（H1N1）NP、M及NS基因核苷酸序列在遗传进化树中均与A/swine/Jiangsu/s15/2011（H1N1）位于同一分支上,属于类禽H1N1猪谱系。本试验对6株H1N1亚型SIV的NP、M及NS全基因序列进行分析,在一定程度上揭示了天津地区H1N1亚型SIV的基因进化与流行情况。     

H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/GD/2/12基因特征分析

2012年从广东省某猪场的疑似流感猪群采集鼻拭子样品,接种鸡胚并收集尿囊液,通过血凝、血凝抑制和RT-PCR,鉴定出1株H1N1亚型猪流感病毒,命名为A/Swine/GD/2/12。RT-PCR扩增得到全基因8个片段,与GenBank收录的参考毒株比对并构建进化树,发现本毒株可能是H1N1亚型重组株,其8个片段与我国猪源和北美地区1985—1992年间的猪源、禽源(A/turkey/IA/1992)和人源(A/Maryland/12/1991)流感毒株在同一个大分支上,其中与我国猪源参考株同源性在95.8%以上,与北美地区的H1N1参考株同源性在94%以上。HA受体位点分析表明,本毒株既具备结合Saα2,6Gal型人类流感病毒SA受体的特点,也有结合Saα2,3Gal型禽类流感病毒SA受体的可能。提示本毒株可能是由北美地区猪源、禽源和人源的H1N1亚型流感病毒重排形成的。HA蛋白裂解位点分析、NS和PB2蛋白位点分析表明,本毒株具备低致病性毒株的特点。小鼠致病性试验进一步证实本毒株能够引起小鼠运动减少、食欲欠佳、体重减轻等表现,但不会引起咳嗽和死亡等严重反应。     

A/African Startling/England-Q/983/79(H7N1)与我国H7N2亚型禽流感病毒分离株的比较

本研究通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别扩增了禽流感病毒A/AfricanStartling/Eng-land-Q/983/79(A.S/E.Q)(H7N1)的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA基因,将其分别克隆到PMD18-T载体后进行序列测定;并将克隆到的8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较分析。结果表明所克窿到的8个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架;HA、NA基因的序列分析表明A.S/E.Q符合低致病力禽流感病毒的特征;与我国H7N2亚型AIV分离株A/chicken/Hebei/1/02的序列比较发现,A/chicken/Hebei/1/02的HA、M、NP、PB1、PA基因与A.S/E.Q同源性最高,说明我国北部分离的AIV起源于A.S/E.Q。     

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析

本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2).该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7 ％～98.1％、94.4 ％～99.5％和88.6 ％～97.6％;与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7％～98.5％、82.5 ％～99.9％和87.6 ％～98.4％;M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1％以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6％以上.基因型分析表明分离株的PB2、PBI、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒“混合器”的作用.     

1株H3N8亚型马流感病毒的分离鉴定及全基因进化分析

2013年8月某养马厂出现疑似马流感疫情,经分离鉴定为H3N8亚型马流感病毒。为了了解该H3N8马流感分离株(A/equine/Xuzhou/01/2013(H3N8))的基因进化情况,本试验比较了该病毒株,我国已报道的H3N8马流感毒株以及目前全球所使用的疫苗株的病毒基因型,也比较了与抗原性相关的氨基酸的变化情况,为科学防控马流感提供参考依据。采集病死马的内脏样本,进行了A型禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测,将荧光RT-PCR检测阳性样品处理后接种鸡胚尿囊腔,检测分离毒尿囊液血凝性及HA效价。参照已发表的扩增H3N8马流感病毒全基因引物,经RT-PCR扩增出该H3N8亚型马流感病毒(A/equine/Xuzhou/01/2013(H3N8))的8个基因片段,对其测序构建基因进化树,并进行分子特征分析。经过比较分析,该病毒株的HA基因在遗传进化上属于佛罗里达Ⅱ型马流感病毒,其余7个片段都属于马流感病毒中的美洲型。在5个公认的抗原位点中,A/equine/Xuzhou/01/2013与我国2007年的分离株(A/donkey/Xinjiang/2007),目前的疫苗株(Miami/63,Kentucky/81,Suffolk/89,Newmarket/2/93和Avesta/93)相比均发生了一些位点的变异。我国H3N8亚型马流感病毒存在抗原变异,需要进一步对其致病性、免疫原性等特性进行研究,同时还需加强马流感病毒分子流行病学监测。     

禽流感病毒A/Chicken/Mudanjiang/0823/00(H9N2) 株NS1基因的克隆及序列分析

用PCR方法,成功扩增出国内分离株禽流感病毒H9N2型非结构蛋白(NS1)基因cDNA,并将该片段连接到pMD 18-T载体上,转化TGI感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆,提取质粒,经限制性内切酶鉴定,对目的片段进行测序,结果获得了NS1基因全长,约700bp.该片段的核酸序列与已知A/Chick/HongKong/1074/99(H9N2)、A/Chick/HongKong/1073/99(H9N2)毒株序列进行同源性比较,同源性皆为94.37%,氨基酸序列同源性分别为93.91%和93.48%.     

H1N2亚型猪流感病毒HA、NP、NA、M和NS基因的克隆与序列分析

对3株H1N2亚型猪流感病毒(SIV):Sw/GX/17/05、Sw/HN/1/05和Sw/GX/13/06的血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)基因进行克隆和序列分析.结果显示:3株分离毒株HA、NP、NA、M和NS基因之间核苷酸同源性分别为91.3%～98.0%、98.4%～98.8%、97.4%～98.3%、98.8%～99.8%和98.1%～98.4%.遗传进化分析显示:分离毒株与美国分离的三源基因重排H1N2 SIV具有较近的亲缘关系;在HA、NP、M和NS基因进化树中,3株分离毒株均位于古典H1N1亚型SIV群,在NA基因进化树中,3株分离毒株则位于人流感病毒群.HA和NA基因推导氮基酸序列分别与代表毒株古典H1N1 SIV A/swine/Maryland/23239/1991(H1N1)和人H3N2流感病毒A/Buenos Aires/4459/96(H3N2)比较分析显示:HA(95.4%～96.1%)和NA(96.6%～97.2%)具有较高的氨基酸同源性;糖基化位点、抗原位点和受体结合位点(HA)处氨基酸存在一定的差异,这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究.     

猪流感病毒分离株A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分子特性研究

采用套式PCR检测方法,结合鸡胚分离鉴定,从20份患呼吸道疾病猪的鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒。经亚型鉴定及全基因组序列分析,证实该分离株为H1N1流感病毒,命名为A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)。遗传进化分析表明该分离株与类禽猪流感病毒(Avian-Like H1N1)相似性最高。蛋白序列分析发现,该分离株具有低致病性流感病毒特征,即其HA蛋白的裂解位点为PSIQSR↓GLFGAI。此外,该基因中有7个潜在的糖基化位点,受体结合位点为108(Y)、148~152(GVTAA)、167(W)、197(H)、204~212(DQQ SLYQNA)和238~243(RDQEGR);其中225~228EQAG显示该分离株具有结合SAα2,6Gal受体的能力,证明该分离株具有感染哺乳动物的能力。同时PB2蛋白的627E、701N及NS蛋白的92D位点均证明了该分离株的低致病性和感染哺乳动物的能力。     

1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒遗传演化分析

为分析1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,对2021年从北京圆明园遗址公园送检的黑天鹅样品中鉴定出的1株H5N8亚型禽流感病毒(A/Wild swan/China/Beijing0201/2021)的全基因组进行扩增、克隆与序列测序,并应用分子生物学软件对其进行遗传演化及关键氨基酸位点分析。结果显示,该H5N8亚型禽流感病毒株属于clade2.3.4.4b进化分支,其PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、MP、NS基因均与H5N8亚型AIV的相应基因片段具有较高同源性,且与2020-2021年越南、哈萨克斯坦、俄罗斯、柬埔寨、法国等地的H5N8毒株密切相关。氨基酸位点分析显示,该毒株HA蛋白裂解位点呈现高致病性禽流感病毒的分子特征,且出现S137A、T160A、T192I、S227R氨基酸突变,158位缺失糖基化位点,这些位点的突变均能够增强H5亚型禽流感病毒对人源唾液酸受体结合的能力;该毒株的PB2蛋白、NP蛋白、M1蛋白和NS1蛋白均存在多个可以增强流感病毒在哺乳动物体内的复制能力和致病性的关键氨基酸位点。研究结果可为H5N8亚型禽流感病毒的进化规律研究及...     

两株H3N2亚型猪流感病毒的遗传进化及分子特征分析

为对2012年广州规模化养猪场疑似流感病料中分离鉴定的2株猪流感病毒A/swine/Guangdong/1519/2012(H3N2)(简称GD1519)和A/swine/Guangdong/1520/2012(H3N2)(简称GD1520)进行遗传进化及分子特征分析,对两株病毒进行了全基因组的测序分析。通过对其8个基因片段的基因来源进行分析,构建系统进化树,遗传进化分析结果显示GD1519 HA、PB2、PA和NP基因片段均来源于近期人源H3N2亚型Moscow/99-like亚分支;其NA和PB1基因片段来源于早期人源H3N2亚型Victoria/75-like亚分支;其M和NS基因片段来源于近期人源H3N2亚型New York/99-like亚分支。GD1520病毒的HA基因片段来源于近期人源H3N2亚型Moscow/99-like亚分支;其NA和PB1基因来源于近期人源H3N2亚型New York/99-like亚分支;其PB2、PA、NP、M和NS基因片段均来源于早期人源H3N2亚型Victoria/75-like亚分支。分析结果暗示2株病毒可能均由不同时期的类人源H3N2亚型流感病毒间基因重排而产生的新型H3N2亚型猪流感病毒。本研究结果进一步证明猪可能是不同来源流感病毒的基因"混合器",开展猪流感病毒相关分子流行病学研究具有重要的公共卫生意义。     

一株猪流感病毒A/swine/Shanghai/01/2019(H1N1)的分离鉴定及遗传进化分析

为鉴定上海地区猪流感病毒的流行株及其分子生物学特征,本研究从上海地区养殖场采集疑似流感症状的猪咽拭子样品40份,采用套式PCR结合鸡胚分离鉴定方法,从中分离到1株H1N1亚型猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Shanghai/01/2019(H1N1)。经全基因组测定和遗传进化分析结果显示该分离株的8个基因节段与欧亚类禽H1N1 SIV同源性最高,其PB2、PB1、PA基因节段可能来源于A/swine/Jiangsu/49/2012(H1N1)病毒,NA、NP和M基因节段可能来源于A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)病毒。该分离病毒的HA蛋白裂解位点为PSIQSR↓GLFGAI,为低致病性流感病毒的分子特征。该分离株NA蛋白未出现与神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变,M2蛋白S~(31)N突变表明该病毒可能对金刚烷胺类药物具有一定的耐药性。PA蛋白~(224)S和PB2蛋白~(701)N突变提示该分离株对哺乳动物的适应性增强,可能导致其致病性增强,需要加强对此类SIV的监测。结合近年来的监测表明,上海地区猪群中H1N1亚型SIV持续存在,需要持续跟踪监测SIV变异趋势。本研究为防控猪流感提供实验依据。     

一株禽源高致病性H7N9亚型流感病毒分子特性研究

为了研究一株禽源高致病性H7N9亚型流感病毒,分析其变异进化及部分生物学特性,试验以从H7N9亚型流感病毒阳性病死鸡的肺脏组织中提取的总RNA为模板,利用特异性引物扩增出全基因序列,分析其核苷酸和氨基酸序列,利用同源建模在线服务软件SWISS-MODEL对突变位点附近的氨基酸序列空间结构进行研究。结果表明:PCR扩增出H7N9亚型流感病毒8个基因片段,即HA、NA、PA、PB1、PB2、NP、NS、M,这8个基因片段均与A/Chicken/Heinan/ZZ01/2017(H7N9)的相应片段具有较高的同源性; HA的第135,226位和NA第401,429位氨基酸存在突变;除A135V突变外,L226Q、A401T、K429R突变均能导致受体结合位点或唾液酸结合位点体积的改变。说明根据基因同源性分析结果,黑龙江省的H7N9流感疫情可能是从中国中部地区传播而来;根据受体结合位点的分析结果,L226Q、A401T和K429R突变可能影响病毒与宿主细胞间的相互作用。     

A型流感病毒NS1蛋白的结构与功能

A型流感病毒片段8编码的NS1蛋白是病毒复制和传播的重要调节蛋白。它含有3个功能区,即RNA结合区,eIF4GI结合区和效应区。NS1蛋白在A型流感病毒感染细胞中高水平表达,它的主要功能是抑制NF-κB(nuclear factor-κB)活化和IFN(inter-feron)-α/β介导的抗病毒作用,抑制Jun N末端激酶(jun N-terminal kinase,JNK)和AP-1(activating posttranslation)转录因子活化;下调病毒感染细胞凋亡;促进病毒基因表达,抑制宿主mRNA加工和转运。NS1蛋白的深入研究,为今后预防和治疗A型流感病毒寻找突破口。     

禽流感病毒A/duck/Fujian/31/2007(H5N1)株M1 基质蛋白的原核表达与免疫原性鉴定

经生物学软件DNAStar分析,参照已发表的禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)(H5N1)基因组序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约750 bp的M1基因片段,将目的片段定向克隆至pET30a表达载体,经酶切及测序鉴定正确后转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,BCA法测定纯化蛋白的浓度为0.656 mg/mL,免疫印迹检测结果表明,纯化的重组蛋白具有良好的反应活性。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测结果表明,重组蛋白可产生抗M1蛋白特异性抗体,具有良好的免疫原性。本研究成功表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,且重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研制H5N1亚型流感病毒诊断试剂及基因工程疫苗奠定基础。     

一株H1N1亚型猪流感病毒的遗传演化分析及在雪貂体内复制和飞沫传播能力评估

本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列经BLAST比对,得到与该SIV各基因节段序列同源性最高的病毒株,采用mafft分析其各基因节段编码氨基酸序列的分子特征,利用MEGA5.1软件分别构建该病毒8个基因节段的进化树。结果显示,SIV TJ312株各基因节段与2016年分离自天津的H1N1 SIV相应各基因节段的同源性在99%～100%。进化树结果显示该病毒株HA、NA和M基因均来自欧亚类禽H1N1 (EA H1N1) SIV谱系;PB2、PB1、PA和NP基因来自2009/H1N1流感病毒谱系;NS基因来自北美三重配H1N2 SIV谱系。蛋白分子特征分析结果显示,HA蛋白碱性氨基酸裂解位点序列为PSIQSR↓G,符合低致病性流感病毒分子特征;受体结合位点符合人源唾液酸受体(α-2,6唾液酸受体)的分子特性;NA蛋白aa275为H、aa295为N,且该蛋...     

一株H5N3亚型禽流感病毒全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究

为了解H5N3亚型流感病毒的生物学特性,本研究对2017年浙江省分离到的一株H5N3亚型禽流感病毒(AIV)[DK/ZJ/S1368/2017(H5N3)]进行了遗传演化分析及小鼠感染性实验。遗传演化分析结果显示,该株病毒的HA蛋白裂解位点处仅含一个碱性氨基酸,属于低致病性AIV。同时,该病毒的血凝素(HA)基因与H5N7亚型流感病毒亲缘关系较近;聚合酶碱性蛋白2(PB2)基因和核蛋白(NP)基因与H10N7亚型流感病毒亲缘关系较近;碱性聚合酶蛋白1(PB1)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近;酸性聚合酶蛋白(PA)基因与H6N2亚型流感病毒亲缘关系较近;神经氨酸酶(NA)基因与H10N3亚型流感病毒亲缘关系较近;基质蛋白(M)基因与H3N8亚型流感病毒亲缘关系较近;非结构蛋白(NS)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近。表明其基因来源复杂。小鼠感染实验结果显示,该分离株无需提前适应即可以在小鼠肺脏和鼻甲中复制,小鼠感染病毒后无明显临床症状,与对照组相比其体质量变化不明显,表明该病毒对小鼠呈低致病性。本研究通过对该H5N3亚型AIV的生物学特性的分析,发现该病毒基因来源复杂,无需提前适应就可以在小鼠体内复制,具有感染哺乳动物的潜在威胁,提示应当持续加强对H5N3亚型AIV的监测和相关生物学特性的研究工作。