小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养

为了探讨小鼠卵巢颗粒细胞体外生长的特点及增殖的调控因素,分别添加2μg/mL胰岛素、50ng/mL FSH和20 ng/mL EGF的培养液培养小鼠卵巢颗粒细胞,每隔24 h对细胞进行计数,研究其对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。此外,还对培养过程中出现的卵巢颗粒细胞集落进行了AKP染色和C-kit免疫组化染色鉴定。结果显示,在培养的第4天添加EGF组和FSH组与对照组相比均具有显著的促增殖作用(P<0.05),添加胰岛素组促增殖作用不显著(P>0.05);卵巢颗粒细胞集落经AKP染色和C-kit免疫组化染色均呈阳性。提示EGF和FSH对小鼠卵巢颗粒细胞具有促增殖效应,小鼠卵巢颗粒细胞具有干细胞的部分特性。     

血清体积分数对培养黑山羊成纤维细胞的影响

为了建立并完善吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞培养体系,为进一步的克隆试验提供最佳生长状态的供体细胞,在常规培养液的基础上添加不同浓度的新生牛血清(0,5%,10%,20%,40%),每天在倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态,并用台盼蓝染色法统计细胞数目,连续观察7 d,绘制生长曲线,比较不同血清体积分数的培养液对吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞体外培养的影响。结果表明,吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞虽然在不同血清体积分数的5组中均有生长增殖,但生长状态不同,差距较大;其中,10%的血清培养液试验组培养的细胞生长状况最好,细胞形态完整清晰,增殖快,数量多,更适合此细胞的生长。不同体积分数血清的培养液对成纤维细胞的生长具有一定影响,10%血清体积分数的培养液最适合吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞的培养。结果可为进一步研究克隆、基因转染、构建基因文库等提供生物学材料。     

乙二胺四乙酸钠对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响

探讨乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响.利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在不添加或添加不同浓度EDTA-Na的成熟培养液中体外成熟44～48 h,挑选核成熟卵母细胞进行孤雌激活,然后移到不添加或添加不同浓度EDTA-Na的胚胎培养液中进行体外培养168 h.结果表明:(1)胚胎培养液中添加适当浓度(25～100 μmol·L-1)EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-Na浓度为100 μmol·L-1时,效果最佳;(2)成熟液和胚胎培养液中同时添加100 μmol·L-1EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用;(3)成熟液或/和胚胎培养液中添加不同浓度EDTANa对体外成熟培养后的猪核成熟卵母细胞及孤雌激活后的4-细胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱都无显著影响.     

绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养中促卵泡素和胰岛素浓度优化研究

为了进一步探讨在无血清体外培养条件下,促卵泡素(FSH)和胰岛素对绵羊卵巢颗粒细胞的影响,以优化颗粒细胞体外培养体系。试验设计6个FSH浓度梯度和3个胰岛素浓度梯度。体外培养7d后,检测培养体系中颗粒细胞数和雌激素浓度。与对照组相比,培养液中添加FSH与胰岛素可显著提高颗粒细胞的增殖和雌激素的分泌(P<0.01);且随着FSH浓度的增加,颗粒细胞数和雌激素分泌量显著增加,当FSH浓度为5.0μg·L-1时,雌激素分泌量最高;随着胰岛素浓度增加,颗粒细胞数和雌激素分泌量显著增加,当胰岛素浓度为10μg·L-1时,颗粒细胞数和雌激素分泌量最高。     

绵羊卵泡颗粒细胞体外培养条件的优化

为了探讨绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养时FSH(Invitrogen)与胰岛素的最佳质量浓度,试验在无血清条件下培养绵羊卵泡颗粒细胞,并向其中加入不同质量浓度的FSH与胰岛素,体外培养7 d后测定细胞数目以及培养液内雌二醇浓度。结果表明,当培养液内FSH质量浓度为25 ng/mL、胰岛素质量浓度为100ng/mL时,颗粒细胞的数目最多;当FSH质量浓度为1 ng/mL、胰岛素质量浓度为10 ng/mL时,培养液内雌激素质量浓度最高。     

牛胚胎体外培养体系的优化

将体外受精后的牛卵母细胞随机分组进行培养,比较了胎牛血清(FBS)和发情后7 d牛血清(E 7BS)、不同培养液(CR 1+3 m g/mL BSA、SOF+3 m g/mL BSA和SOF+0.1 m g/mL PVA)、共培养体系和不同培养液体积(0.1,0.5和2.0 mL)对胚胎发育的影响,优化了牛胚胎体外培养体系,并对该体系的稳定性进行了检验。结果表明,优化后的牛胚胎培养体系为:前48 h用CR 1+3 m g/mL BSA培养液,48 h后用CR 1+体积分数10%E 7BS培养液培养120 h,培养液体积为0.5 mL,并且采用共培养,受精后颗粒细胞保留48 h。用该培养体系培养的牛胚胎发育良好,平均囊胚率为44.9%,表明该优化培养体系较稳定。     

EGF和FBS对牛孤雌胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液中分别添加0,10,30,50ng/mL表皮生长因子(EGF),24h检查成熟率,将成熟的卵母细胞置于5μmol/L离子霉素(Ionomycin)中激活5min后,在含有6-DMAP和CCB的培养液中培养4h,最后移入CR1培养液中培养,并在孤雌激活后第0,2,4,6天添加体积分数10%的胎牛血清(FBS),7～8d后检查囊胚率,探讨牛成熟培养液中添加EGF及FBS对牛孤雌胚体外发育的影响。结果表明,添加30ng/mL的EGF能促进卵母细胞的成熟率和孤雌囊胚的发育率;在第4天添加FBS更有利于胚胎的发育。     

家兔原始卵泡卵母细胞体外发育的培养体系研究

本研究根据家兔卵巢的发育特征初步探讨了家兔卵巢卵母细胞体外发育的培养体系。采集新生或30日龄家兔卵巢在不同培养液中培养,并分析家兔卵母细胞的体外发生与成熟情况与体内正常发育的兔卵巢卵母细胞之间的差异,来筛选和优化家兔卵巢卵母细胞的体外培养体系。本试验从高糖DMEM、FSH浓度、BSA/血清等3个方面来筛选较好的培养条件,结果表明:①不添加高糖DMEM的M199培养液与添加的相比,卵巢上卵母细胞数量要多,但随着培养时间的延长,组织块上卵母细胞的形态会变得不清楚;②家兔卵巢组织在FSH浓度为50和100m IU/m l、添加血清的DMEM/F12培养液中生长较好,体外培养24d后,卵母细胞数量多,直径增加到65μm;③与添加BSA的培养液相比,添加血清的培养液中的卵巢卵母细胞生长状态较好,体外培养28d后,卵母细胞数量多,并且直径可达65μm。     

山羊卵母细胞孤雌激活和孤雌胚体外发育研究

为寻求适合于山羊卵母细胞孤雌激活的方法,本试验采用离子霉素对体外成熟山羊卵泡卵母细胞进行孤雌激活,同时比较了培养液中添加不同类型的血清对孤雌激活胚体外发育的影响。结果表明:用2.5、5.0和10.0μmol/L离子霉素处理卵母细胞,卵裂率分别为72.3%、75.6%和70.3%,囊胚率分别为40.8%、45.4%和39.4%,均无显著差异(P>0.05)。用5.0、10.0、15.0和20.0μmol/L钙离子载体Ca-A23187处理卵母细胞,卵裂率分别为50.5%、62.5%、60.4%和60.2%,其中5.0μmol/L Ca-A23187处理组的卵裂率极显著低于其他处理组(P<0.01),但各组的囊胚率无显著差异(P<0.05)。用30、70、110和150 mL/L乙醇处理卵母细胞,卵裂率分别为40.6%、63.7%、64.2%和65.3%,其中30 mL/L乙醇组的卵裂率极显著低于其他各组(P<0.01),30和150 mL/L乙醇组的囊胚率极显著低于70和110 mL/L乙醇组(P<0.01)。在培养液与颗粒细胞共同培养条件下,分别添加100 mL/L的发情牛血清(OCS)、胎牛血清(FCS)和...     

血清及山羊卵丘细胞共培养对猪胚胎体外发育的促进作用

为进一步完善猪胚胎体外发育系统,以孤雌激活胚胎为研究对象,依次对胚胎培养液种类、培养期间血清添加方式、卵丘细胞共培养体系进行筛选优化。结果表明,与常规的PZM3培养液相比,CR1aa并不适合猪胚胎的体外发育;猪胚胎在PZM3中培养4d后添加10%胎牛血清培养至第6天,体外发育能力得到显著改善,卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率、囊胚细胞数分别达到95.1%、56.5%、27.3%、79.3;在此基础上,利用山羊卵丘细胞与猪胚胎进行共培养,将囊胚孵化率进一步提高至36.6%,初步建立了一套高效稳定的猪胚胎体外发育系统。     

山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立

为研究乳腺上皮细胞增殖和分化特性及其基因表达的分子机制 ,建立了山羊乳腺上皮细胞培养体系。用无菌手术法从健康第二胎泌乳期山羊乳腺取得组织块 ,在体外条件下用组织块法进行原代培养。基础培养液用 RPMI1 6 4 0 ,含胎牛血清 1 5 0 m L/ L,添加 EGF(1 0 μg/ L)、胰岛素 (0 .1 m g/ L)、E2 (1 μg/ L)、氢化可的松 (0 .1mg/ L)、孕酮 (1 m g/ L)、青霉素 (0 .1 g/ L)及链霉素 (0 .0 5 g/ L) ,在铺有胶原的塑料培养板上培养。从细胞接种存活率、细胞群体倍增时间、细胞生长曲线和细胞分裂指数 4个方面考察了乳腺上皮细胞的生物学性状。结果表明 ,在此培养体系中 ,山羊乳腺上皮细胞生长良好 ,增殖旺盛。细胞产物电泳及蛋白印迹分析结果表明 ,培养的细胞为山羊乳腺上皮细胞 ,并具有表达山羊酪蛋白的功能     

血清饥饿法同步化牛卵巢颗粒细胞周期的研究

研究了体细胞制备过程中细胞培养时间、血清饥饿浓度和饥饿对间对体细胞周期同步化的影响.体细胞为牛卵巢颗粒细胞,细胞用碘化丙啶(PI)染色法,用流式细胞仪检测细胞周期.细胞传代培养至第2、10和25代,在0.5％和0.05％的血清饥饿浓度下诱导处理2、3、4和5d.试验结果表明,第2、10和25代的细胞在G0/G1期的比例没有差异(P＞0.05).培养液中添加0.5％ FCS和0.05％ FCS较对照组(10％FCS)提高了细胞G0/G1期的比例(P＜0.05),0.5％FCS和0.05％ FCS试验组获得了相近的细胞G0/G1期比例(P＞0.05).血清饥饿至第5天的细胞较第2天的细胞有高的G0/G1期的比例(P＜0.05).结果显示,体外培养至不同代的牛卵巢颗粒细胞对G0/G1期的比例没有影响,血清饥饿和延长血清饥饿的时间能够有效诱导体细胞进入G0/G1期.     

ROS对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

【目的】研究周期依赖性蛋白激酶抑制剂(Roscovitine,ROS)对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。【方法】将山羊卵母细胞置于含不同浓度(0(对照),20,40,80,120,160,200μmol/L)ROS的成熟液中培养24h统计第一极体排出率,初步筛选山羊卵母细胞成熟培养液中添加ROS的有效浓度;将山羊卵母细胞在含不同浓度(0(对照),40,80,120,160,200μmol/L)ROS的抑制培养液中培养8或16h,再转入常规培养液中培养至24h,统计第一极体排出率,确定ROS适宜的浓度和作用时间。将卵母细胞放入添加40μmol/L ROS的培养液微滴中进行抑制培养,抑制培养8h后分别再常规培养0,2,4,6,8,10,12,14,16h,统计各处理第一极体排出率。将山羊卵母细胞在最佳ROS处理方案下抑制培养后进行孤雌激活,观察孤雌胚的发育情况。【结果】成熟培养液中加入40μmol/LROS抑制培养山羊卵母细胞8h后再转入常规培养液中培养至24h,是比较理想的ROS处理方案。山羊卵母细胞成熟培养的16h以前,全程抑制和抑制8h再常规培养2个试验组第一极体排出率与常规对照组无显著差异;分别培养18,20,22h时,2个试验组第一极体排出率均极显著低于对照组;24h时,抑制8h再常规培养组第一极体排出率(58.76%)与对照组(63.13%)接近,无显著差异。试验组成熟卵母细胞孤雌激活胚的囊胚率(46.75%)显著高于对照组(36.04%,P<0.05)。【结论】山羊COCs成熟培养液中加入40μmol/L ROS培养8h再转入常规培养液培养至24h,是山羊卵母细胞核质同步成熟较适宜的方案,此方案可以有效抑制18～22h核成熟卵母细胞的减数分裂恢复,推迟4～6h成熟,达到培养24h核质同步成熟的目的,提高了体外培养卵母细胞的质量。     

超排山羊卵巢卵母细胞体外成熟的初步研究

对超排山羊卵巢卵母细胞进行体外成熟培养的初步研究:试验一,分别用6、7、9、16号针头抽吸2～6mm卵泡,获有用卵母细胞百分率:分别为61.67％(37/60)、65.92％(178/270)、56.73％,(59/104)、31.43％(22/70);试验二,以TCM 199+10mol/L MHEPES+青霉素(6μg/m1)+链霉索(5μg/ml)为基础培养液(BM),再分别加入不同成分,配成5种卵母细胞成熟液:(A)BM+10％EGS(发情羊血清),(B)BM+10％EGS+HCG(2.5μg/ml,),(C)BM+10％EGS+HCG+E,(1μg/ml),(D)BM+10％FCS+HCG十E_2; (E)BM+10％EGS+HCG+E_2+颗粒细胞(1.5×10~6～3.0×10~6个/ml)。在38.5℃,5％CO_2培养26h,排卵后第1天卵巢母细胞体外成熟率分别为67.67％(20/30),60.42％(29/48),83.67％(41/49),67.79％(40/59),80.82％(59/73),排卵后第5天卵巢卵母细胞,在培液D中体外成熟率为71.43％(45/63)。研究表明,超排山羊卵巢卵母细胞经体外成熟可获得大量廉价的成熟母细胞。     

山羊卵母细胞体外成熟因素的研究

建立和优化山羊卵母细胞体外成熟的培养体系,对山羊卵母细胞的采集方法、割卵液种类、培养液添加血清种类等因素进行了研究.结果显示切剖法与抽吸法对山羊卵母细胞的成熟有显著差异(P<0.05);割卵液DMEM/F-12与PBS+BSA对山羊卵母细胞的成熟有极显著差异(P<0.01);添加EGS(自然发情)、EGS(PG诱导发情)、FBS对山羊卵母细胞的成熟有极显著差异(P<0.01).结论:切剖法能更好地支持卵母细胞的成熟;DMEM/F-12作为割卵液,能显著提高卵母细胞的成熟率;自然发情的山羊血清对卵母细胞的成熟效果最好,同种血清对卵母细胞的成熟效果要好于异种血清.     

Cu2+诱导刺激对喜树悬浮培养细胞喜树碱生物合成的影响

[目的]探讨Cu^2＋作为诱导子对喜树悬浮培养细胞喜树碱积累的影响。[方法]在喜树悬浮培养细胞中,细胞生长的不同阶段,添加不同终浓度的Cu^2＋,诱导刺激喜树碱的生物合成。[结果]0.5μmol/L终浓度的Cu^2＋在第8天添加对细胞的生长最有利,而40.0μmol/L终浓度的Cu^2＋在第18天添加对喜树碱生物合成最有利。在第8天添加0.5μmol/L终浓度的Cu^2＋后再在第18天添加40.0μmol/L终浓度的Cu^2＋,可以使喜树碱的产量在第24天达到71.9mg/L,是未经处理的7.9倍。[结论]Cu^2＋诱导刺激可以显著提高喜树悬浮培养细胞喜树碱的产量。     

鸡胚成纤维细胞与鸡气管黏膜上皮细胞共培养体系的建立

【目的】建立鸡气管黏膜上皮细胞(Chicken trachea epithelium cells,CTECs)和鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEFs)共培养体系,为CTECs体外培养研究与应用奠定基础。【方法】利用细胞套皿培养方法,使CEFs与CTECs体外共培养在一个营养体系中,用含有不同促细胞生长因子(氢化可的松(HC)、转铁蛋白(TF)、人表皮生长因子(HEGF)或牛垂体提取物(BPE))和血清(胎牛血清、鸡血清)的培养液培养,观察各组CTECs的生长情况,绘制生长曲线,记录CTECs体外生长增殖的特点。【结果】与单独培养的CTECs相比,共培养体系中的CTECs体外贴壁、生长增殖能力均显著提高,72h能够铺满整个培养皿,并呈典型的上皮细胞"铺路石"状排列。共培养体系中的CTECs,在缺少3种重要哺乳动物气管黏膜上皮细胞培养所需的促细胞生长因子培养液中,仍能保持较好的生长能力,大大降低了CTECs的培养成本。【结论】成功建立了CTECs与CEFs的共培养体系,为CTECs的体外培养和应用提供了技术支持。     

水牛卵母细胞体外成熟研究

本试验探讨了激素、卵泡液及颗粒细胞共培养对水牛卵母细胞体外成熟的影响.试验表明,当体外成熟培养液中含有3 μg/ mL FSH时,随着LH添加量的增加,水牛卵母细胞的第一极体排放率和成熟率逐渐提高;添加30 μg/ mL LH水牛卵母细胞的第一极体排放率(26.67 %)和体外成熟率(40.00 %)均显著(P＜0.05)提高.在含有激素的成熟培养液中添加10 %的卵泡液,水牛卵母细胞的第一极体排放率(52.33 %)和成熟率(66.28 %)均进一步显著(P＜0.05)提高.颗粒细胞单层共培养对水牛卵母细胞的第一极体排放率(49.21 %)和成熟率(65.08 %)有提高,但没有统计学意义.在本试验条件下,综合以上成熟培养条件可获得60.61 %的第一极体率和72.73 %的成熟率.     

抗氧化剂对牛卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用及凋亡机制的初步研究

研究抗氧化剂对血清饥饿诱导体细胞凋亡的抑制作用,并初步研究凋亡机制.体细胞为牛卵巢颗粒细胞,以AnnexinV/FITC法染色,流式细胞仪检测凋亡.在10％ FCS和0.5％FCS血清浓度下,第5代细胞在添加抗氧化剂维生素E、硒和谷胱苷肽后培养2d,检测细胞凋亡率.结果显示:添加有维生素E、硒和谷胺酰胺的10％ FCS培养的牛卵巢颗粒细胞凋亡率较对照组低,但差异不显著(P＞0.05).在0.5％ FCS饥饿诱导处理的颗粒细胞试验组,对照组的细胞凋亡率显著高于维生素E、硒和谷胺酰胺试验组(P＜0.05).培养液中添加z - VAD - fmk能够显著降低0.5％FCS试验组的细胞凋亡率(P＜0.05).说明在培养过程中添加抗氧化剂能有效抑制因血清饥饿诱导而产生的牛颗粒细胞凋亡,血清饥饿诱导细胞产生凋亡的过程包括caspase的激活.     

山羊输卵管上皮细胞的分离与培养

【目的】分离并培养山羊输卵管上皮细胞,研究其生长特性。【方法】采用胰酶、胶原酶及机械刮取方法分离输卵管上皮细胞并分析培养效果;选择免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定;向培养液中添加下丘脑粗提物、胰岛素、EGF和血清,探讨其对输卵管上皮细胞体外培养的影响。【结果】胰酶对山羊输卵管上皮细胞的分离效果较差,胶原酶次之,机械刮取方法较好。机械刮取法分离的细胞以细胞团居多,接种后8~12 h开始贴壁生长,生长2~3d细胞呈现明显的铺路石形态。免疫细胞化学染色显示,细胞角蛋白阳性率在95%以上。上皮细胞培养体系中含少量血清及人EGF、胰岛素,能有效促进原代和传代输卵管上皮细胞的生长,以体积分数5%血清+EGF的培养效果较好。【结论】采用机械刮取法分离培养的输卵管上皮细胞,在体外可连续传到第8代,传代细胞活性强、纯度高,可为输卵管上皮细胞相关功能的研究提供材料。