小麦叶锈菌特异分子标记建立

利用21对EST-SSR引物、30对SSR引物及40对小麦叶锈菌EST引物,以小麦条锈菌为对照,对小麦叶锈菌基因组DNA进行PCR扩增筛选。三类引物在小麦叶锈菌和小麦条锈菌基因组中分别扩增出55、77、53个稳定条带,其中多态性条带分别为25、36、12个,平均多态性百分率分别为45.45%,46.75%,22.64%。每对引物等位基因数为1~9,3种引物平均等位基因数分别为2.6、2.6、1.3。2对小麦叶锈菌中单一等位基因的EST引物EST-6和EST-23可在小麦叶锈菌中分别扩增出625和384bp的特异片段。进一步用其他6种锈菌和小麦散黑穗病菌对这2个特异引物进行检测,均未扩增出其特异性片段,表明引物EST-6和EST-23在小麦叶锈菌中具有特异性。     

中国小麦条锈菌主要小种和流行菌系的AFLP分析

【目的】明确近年来我国小麦条锈菌主要小种及流行菌系的分子遗传关系。【方法】利用AFLP技术,对我国近年来小麦条锈菌(Puccinia striiformisf.sp.tritici)的主要流行菌系,特别是水源11类群进行了DNA指纹分析,并与毒性分析结果进行了比较。【结果】(1)小麦条锈菌流行菌系之间,无论是毒性特征还是DNA指纹特征,均存在丰富的遗传变异,但二者并不相关;(2)AFLP聚类分析显示,水源11类群的不同类型之间并没有很近的亲缘关系,其在遗传上不属于同一个来源。【结论】新出现的致病类型很可能由较近的共同起源菌系进化而来;AFLP技术非常适合于小麦条锈菌的遗传分析,能客观揭示小种(菌系)之间的亲缘关系。     

微量提取小麦叶片中条锈菌DNA的方法初探

小麦条锈菌DNA的提取对于研究条锈菌遗传群体结构,条锈菌遗传多样性以及揭示条锈菌群体类型和预测优势小种的流行,具有重要的意义。但是常规的病原菌DNA提取首先需要获得大量的病原物纯化体,再对病原物进行DNA提取,费时费力。本文直接对含有条锈菌的小麦叶片标样进行DNA提取,从中获得条锈菌的DNA,用于后续研究。既节省了大量的人力、物力和财力,又为快速检测和获得所需的DNA提供了参考方法,为快速了解病原菌的群体遗传结构变化和毒性演化的规律创造了可行性,为深入研究小麦条锈菌群体生物学和流行学奠定了基础。     

小麦秆锈菌特异性SSR分子标记的开发

 【目的】研发简单、快速、准确的分子检测技术用于小麦秆锈菌的准确诊断和秆锈病的早期预警。【方法】采用FIASCO法构建秆锈菌基因组微卫星富集文库,分离微卫星DNA序列,设计合成小麦秆锈菌的特异性引物。【结果】根据小麦秆锈菌基因组微卫星富集文库,设计1对小麦秆锈菌特异性微卫星引物Pgtfssr1(f/r),可在来自中国不同麦区的20份小麦秆锈菌分离物基因组DNA中扩增出395 bp的特异性片段,而在小麦条锈菌、小麦叶锈菌和其它麦类病原真菌中未扩增出该特异性片段。病菌侵入寄主30 h后便可检测到特异性DNA片段的存在,灵敏度达到1 ng•μL-1模板DNA浓度水平。【结论】成功研发出小麦秆锈菌的特异性SSR分子标记,为小麦秆锈病早期诊断在生产上的应用奠定了基础。     

小麦叶锈菌2个候选效应因子的克隆及其qRT-PCR分析

小麦叶锈病是由隐匿柄锈菌（Puccinia triticina, Pt）侵染的一种气传性真菌病害,对小麦造成严重的产量损失。Pt产生的吸器是产生效应因子的主要场所,而效应因子是Pt致病的关键。本研究基于早期构建的小麦叶锈菌单胞菌系13-5-28-1(JHKT)在休眠孢子、萌发夏孢子和侵染6 d的转录组文库,在系统筛选候选效应因子的基础上,选取两个候选效应因子Pt12448和Pt34354进行克隆,利用qRT-PCR分析候选效应因子的表达模式,结果发现其中Pt12448基因表现为后期诱导上调,Pt34354基因则为前期诱导上调。研究结果将推进对小麦叶锈菌致病机制的研究进程。     

小麦条锈菌AFLP体系的优化

[目的]优化小麦条锈菌AFLP体系。[方法]以小麦条锈菌大田混合菌系为材料,采用改良CTAB法提取DNA,探索酶切、PCR过程,优化小麦条锈菌AFLP体系,并从64对引物中筛选出稳定、高效的引物组合。[结果]改良CTAB法有较好的破壁效果,所提DNA纯度高,条带清楚,无污染,适合AFLP操作。酶切3.0、3.5 h的效果相同,扩出的片断在100~2 000 bp,可进行预扩。TaqDNA聚合酶为0.5 U时,电泳图中出现了较亮的条带,片断大小在100~2 000 bp。16对引物组合可以扩增出较稳定的条带。[结论]优化的小麦条锈菌AFLP体系为:25.0μl酶切体系,37℃酶切3.0 h,10.0μl连接体系在22℃条件下连接过夜,连接产物、预扩产物分别按1∶10、1∶30的比例用ddH2O稀释后用于预扩和选择性扩增。     

中国小麦条锈菌4个流行小种的RAPD标记

以210条随机引物,对目前中国小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.Tritici)的主要优势菌系进行了RAPD片段的规模筛选,寻找到了条中31号、条中29号、条中23号、水源类型4个流行生理小种的特异性RAPD标记。此结果表明,通过寻找小麦条锈菌生理小种的特异性RAPD片段,能够建立起中国小麦条锈菌生理小种的分子检测体系。     

小麦条锈菌DNA提取方法的比较研究

以小麦条锈菌夏孢子为实验材料,分析比较了CTAB法、SDS法、尿素法和CTAB/SDS法4种方法对小麦条锈菌基因组DNA的提取效果。结果表明,利用4种方法提取的小麦条锈菌夏孢子DNA的纯度和得率存在一定差异,单位重量夏孢子分离的DNA量依次为:CTAB法>尿素法>CTAB/SDS法>SDS法,而所获得的DNA纯度依次为:CTAB/SDS法>CTAB法>SDS法>尿素法。以不同分离方法获得的小麦条锈菌DNA为模版,利用特异性微卫星引物RJ17进行PCR扩增和电泳分析,4种方法均能满足SSR反应,但CTAB法更适于SSR反应。     

小麦3种锈菌PCWDEs家族基因鉴定及表达分析

为挖掘小麦锈菌侵染过程中发挥关键作用的植物细胞壁降解酶（Plant cell wall-degrading enzymes,PCWDEs）基因,通过生物信息学方法对小麦3种锈菌（叶锈菌、条锈菌和秆锈菌）基因组中的碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes, CAZymes）进行预测分析,在此基础上对其中的PCWDEs基因家族进行全基因组范围的筛选鉴定,并利用qRT-PCR方法对叶锈菌PCWDEs家族成员在侵染过程中的转录水平进行了检测分析。结果表明：1）小麦叶锈菌、条锈菌和秆锈菌基因组分别编码355、322和345个CAZymes家族成员基因以及160、153和158个PCWDEs基因;小麦3种锈菌共含75个保守CAZymes基因亚家族和94个PCWDEs直系同源基因簇。2)16个叶锈菌特异性PCWDEs基因在亲和（Pt15-‘中国春’）/非亲和（Pt15-‘云麦34’）互作过程中均受到不同程度的诱导表达,但非亲和互作中在侵染更早期就已受到诱导上调表达。3）叶锈菌特异性PCWDEs基因簇中有4个PCWDEs被鉴定为类扩展蛋白,其在侵染过程中受到诱导表达,说...     

小麦条锈菌效应蛋白基因 PSTG_23616的时空表达特征分析

明确条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst)效应蛋白基因PSTG_23616的时空表达特征,旨在解析该基因在病菌生长发育及致病过程中的作用。利用RT-PCR和PCR克隆获得PSTG-23616的cDNA和基因组DNA全长;借助生物信息学软件分析PSTG-23616蛋白序列特征并构建系统进化树;通过酵母分泌系统、农杆菌介导的瞬时表达系统、实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)、亚细胞定位技术初步明确该基因的功能。结果表明,PSTG_23616基因组全长937bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)全长699bp。生物信息学软件预测结果显示,PSTG-23616信号肽为位于N端的1~22个氨基酸;酵母分泌系统分析表明,PSTG-23616的信号肽具有分泌功能,为典型的分泌蛋白;注射含有PSTG_23616的重组农杆菌菌液,可抑制由BAX引起的细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)反应;qRT-PCR结果表明,PSTG_23616在小麦条锈菌初侵染过程中一直上调表达,24h表达量达到顶峰;亚细胞定位分析表明,PSTG_23616在整个细胞均有分布。推测,该效应蛋白参与条锈菌侵染结构的分化,同时在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能。     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。     

复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌方法的建立及初步应用

在已经建立的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立胸膜肺炎放线杆菌(App)、多杀性巴氏杆菌(PM)复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增App的342bp和PM的457bp的特异性片段。检测灵敏度分别达9.7pgDNA/1.4×103OCFU和16pgDNA/2.3×103OCFU,用建立的方法检测临床分离的23株可疑菌株,App阳性8株,PM阳性2株,与其它鉴定方法检测结果相符,表明该方法的建立能够对这2种疾病进行临床鉴别诊断。     

白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

微量法提取高质量小麦DNA供大规模PCR分析

介绍了一种在提取小麦DNA实验中常用的CTAB提取方法基础上改良的微量DNA提取方法.通过提取多个材料的DNA并经分光光度计检测,琼脂糖电泳结果表明,这种方法提取的DNAOD260/280在2.00～1.8间波动,较常规大量法提取DNA的质量高,能满足100～200余次的PCR反应的需要.采用该法对提取的普通小麦DNA以及转抗除草剂基因Bar的转基因植株DNA分别进行SSR标记检测和PCR扩增,结果表明SSR标记扩增效果与大量法无明显的差异,抗性植株DNA能扩增出Bar基因的特征带.     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。     

直接、快速地从罹病小麦叶片中提取条锈菌基因组DNA的方法

 小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）是专性程度很高的活体寄生菌,通过分子技术对其进行群体遗传结构研究的过程中,基因组DNA提取是基础之一。本研究利用Chelex 100法和CTAB法直接提取罹条锈病的小麦病叶片上的小麦条锈病菌的基因组DNA,使用PCR对所得到的DNA进行真菌核糖体rDNA ITS和小麦条锈病菌特异性引物CYR33进行检测,对2种基因组DNA的提取方法进行比较分析,结果表明Chelex 100法和CTAB法都能够适合于从罹病组织中直接提取小麦条锈病菌的基因组DNA,但是Chelex 100法较CTAB法所需的样品量少,操作步骤少,操作简单,并且整个过程无需使用有机溶剂进行抽提,对人体比较安全。通过PCR检测DNA提取情况,发现Chelex 100法提取的DNA的PCR结果优于CTAB法,且能够满足基于PCR的群体遗传结构的分析等研究。     

进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测

【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus,BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）,建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L^-1、SMV 0.4 μmol·L^-1,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明,当dsRNA原液稀释至10^-3倍时,无论是多重RT-PCR,还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带,多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当,为10^-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示,BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp,与预期大小完全相符,且与已报道的各病毒基因序列高度同源,证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测,结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV,1份美国大豆种子检出SMV,1份阿根廷大豆种子检出SMV,2份中国大豆种子检出SMV,该结果与单一RT-PCR验证结果一致,阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带,而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。     

甘蔗黑穗病菌DNA提取及PCR检测

本研究利用尿素混合液直接从甘蔗黑穗病菌孢子提取基因组DNA进行PCR检测鉴定,经过反复试验,建立了一种简便、快速的检测鉴定方法。利用建立的方法对12个甘蔗黑穗病样品进行病菌基因组DNA提取,将甘蔗黑穗病菌特异性引物进行PCR检测,均扩增出大小为420 bp的预期DNA片段条带。PCR扩增产物经克隆测序,与GenBank数据库中的甘蔗黑穗病病原菌序列比对,同源性达99%。     

A Multiplex PCR Assay for the Detection of Pathogenic Genes of EPEC, ETEC and EIEC

A multiplex polymerase chain reaction (PCR) was developed to detect three pathogenic genes of en-teropathogenic, enterotocigenic and enteroinvasive Escherichia coli.. In this study three different sets of oligonu-cleotide primer were simultaneously used, and in this way, specific fragments of 880, 600, 150 bp for EPEC eaeA, EIEC ipaH and ETEC ST genes were amplified, respectively. The best condition of the multiplex PCR was: after an initial heat denaturation step at 95℃ for 5 min, followed by 30 cycles of denaturation at 94℃ for 40 s, primer annealing at 51.3 ℃ for 40 s and extension at 72 ℃ for 1 min, final extension at 72 ℃ for 10 min. The detection limit of the eaeA, ipaH and ST primers was 38.7423, 3.60519, 29.9448 ng·mL-1 (4.3×104, 1.5×103, 2.6×104 CFU·mL-1), respectively. It may be a good way for the detection and identification of Diarrhea-causing E. coli. .