牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3（切除CMV启动子）,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。     

奶山羊BLG基因敲除载体的构建

根据已知的BLG序列设计引物,通过PCR技术克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外显子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外显子3、4、5、6、7,分别连入克隆载体pMD18-T Simple载体中并测序。然后以含有正负筛选标记基因的ploxpⅡ载体为基础,将5′端和3′端同源臂片段先后连入其中,进行酶切、PCR鉴定。将构建好的基因敲除载体转化组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌BM25.8,验证Loxp位点的活性。结果表明,构建了奶山羊BLG基因第2外显子缺失的基因敲除载体pBLG2T,且pBLG2T载体中的正选neo基因可以被Cre重组酶去除。为获得BLG 1条等位基因缺失型细胞株以及培育高产优质奶山羊新品种奠定基础。     

TALEN介导猪瘟病毒结构蛋白基因E0敲入山羊乳腺上皮细胞β-乳球蛋白基因座

验证整合于山羊β-乳球蛋白基因座的猪瘟病毒E0(CSFV E0)基因是否能够利用内源性启动子调控该基因表达,为制备转CSFV E0基因山羊做好准备。利用脂质体转染的方法将实验室已构好的针对山羊β-乳球蛋白基因第一外显子的TALENs表达载体和包含CSFV E0基因的打靶载体共转染山羊乳腺上皮细胞,用药物(G418)进行筛选获得单克隆,并对获得的克隆进行5′端和3′端鉴定,鉴定都为阳性的克隆进行激素诱导24h后,收集培养液和细胞。通过RT-PCR和Western blot技术检测证明,转基因阳性细胞能够表达并分泌出CSFV E0蛋白。本试验为以转CSFV E0基因细胞为供核体进行核移植制作转基因动物奠定了基础。     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列(登录号:XM_018066209.1),利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达(P0.05),其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

山羊Myostatin基因打靶载体的构建

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1.4kb、4.5kb.将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%.对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建表达Neo、Tk基因的哺乳动物双标记转基因载体,并命名为ploxp-M .     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术,从小鼠基因组中克隆了1.6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5′上游调控序列,经酶切和测序证实与已知序列基本一致.为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达,将此序列与报告基因CAT融合,构建了pWAP-CAT-polyA乳腺定位表达载体,脂质体包裹后,经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达.分别于家兔分娩后1～10 d采奶,用ELISA检测乳汁中CAT含量.结果表明,所构建的载体在家兔乳腺中能够表达,表达水平在家免分娩后1～5 d较高.     

溶葡萄球菌素基因乳腺特异表达载体的构建与检测及转基因核供体细胞的制备

本研究旨在构建溶葡萄球菌素基因牛乳腺特异表达载体(pEPB),转染牛胎儿成纤维细胞,为制备溶葡萄球菌素基因的转基因克隆牛提供核供体细胞.本研究以pEGFP-C1为载体骨架,通过PCR扩增牛2.6 kb的β-酪蛋白5′调控区及0.6 kb的3′侧翼区(poly A)序列作为调控序列,制备成含有绿色荧光和新霉素筛选标记的牛乳腺特异表达载体,经PCR和酶切鉴定正确后,用转染试剂FuGene HD反复转染牛pEPB乳腺上皮细胞3～5次,用催乳素诱导后,经免疫荧光分析,检测目的蛋白的表达.然后,用电转染法转染牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选得到阳性细胞后,把阳性细胞扩大培养并提取其基因组,因为溶葡萄球菌素基因是外源基因,经PCR及Southern blot 检测来确定目的基因是否已经整合到细胞的基因组上.结果表明,溶葡萄球菌素基因在牛乳腺细胞中得到了表达,并整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中,得到了转溶葡萄球菌索基因的核供体细胞.结果显示,本研究所获得的转基因牛胎儿成纤维细胞可作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究.     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列（登录号：XM_018066209.1）,利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达（P<0.05）,其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

牛BLG／tPA和牛as1酪蛋白／tPA基因在家兔乳腺中的暂时表达

为鉴定和筛选用于制备tPA转基因动物乳腺生物反应器的高效表达载体，试验分别以1.1kb牛b-乳球蛋白（BLG）基因，1．0kb牛asl酪蛋白基因5'端侧翼调控序列与1．7kb经过改造的人组织纤溶酶原激活剂（tPA)cDNA融合，构建了pBLG-PA2和pasl-PA22个乳腺定位表达载体。载体经酶切鉴定正确后，用脂质体包裹，并用毛细玻璃管经乳头管导入妊娠中后期的家兔乳腺，进行暂时表达。分别于家兔分娩后1－15d采奶，采用琼脂糖平板溶圈法测定乳汁中tPA的含量和活性。结果2个载体均获得表达，且pBLG-PA2表达水平高于pasl-PA2。pBLG-PA2和pasl-PA2在家兔乳汁中的含量分别为200－850μg/Lt 50-250μg/L。     

转基因动物乳腺通用表达载体的构建

为进一步研究羊β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因在转基因大动物中的应用,利用克隆的羊ＢＬＧ基因５′和３′区的５ｋｂ和４．２ｋｂ构建乳腺表达载体。为有效利用内含子的作用,克隆了羊ＢＬＧ第１和第２内含子,进行了序列分析,并将２个内含子进行了拼接,构建了有效的乳腺表达载体。该载体方便从原核载体中卸出,并加入３个有利于外源基因插入的克隆位点     

萨能奶山羊、努比山羊及其与云南圭山山羊杂交种SRY基因编码区的分子特征研究

根据GenBank中山羊SRY基因序列设计一对引物,用PCR方法在雄性萨能奶山羊、努比山羊及其与云南圭山山羊杂交种个体中扩增出包含SRY基因整个编码区的特异片段,将特异PCR产物克隆到pMD182-T载体中,再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,筛选SRY基因的阳性克隆进行了测序,将其序列与GenBank中部分偶蹄目动物的SRY基因序列进行同源性比较,并用NJ法构建了系统进化树.结果表明:①萨能奶山羊、努比山羊及其与云南圭山山羊杂交种SRY基因编码区长度均为732 bp,其中包含长度为231 bp的HMG-box,位于编码区的第190至420位核苷酸之间;②萨能奶山羊SRY基因编码区序列与GenBank绵羊、欧洲牛、印度水牛、鹿、麝及猪等偶蹄目动物的同源性分别为96.9%、93.5%、92.6%、90.4%、92.4%、77.2%;努比山羊SRY基因编码区序列与GenBank绵羊、欧洲牛、印度水牛、鹿、麝及猪等偶蹄目动物的同源性分别为96.9%、92.9%、92.1%、90.3%、92.3%、77.1%;努比山羊与云南圭山山羊杂交品系SRY基因编码区序列与GenBank绵羊、欧洲牛、印度水牛、鹿、麝及猪等偶蹄目动物的同源性分别为96.9%、93.4%、92.5%、90.3%、92.3%、77.2%;③根据SRY基因编码区的核苷酸序列构建的物种间系统进化树结果基本与这些偶蹄目动物的传统系统分类相一致.     

牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L ,且表达一直持续整个泌乳期     

奶山羊CIDEa基因的克隆、序列分析与组织表达

为获得奶山羊CIDEa基因序列并检测其在乳腺组织中的表达,采用RT-PCR技术从奶山羊乳腺组织扩增CIDEa基因序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并采用荧光定量PCR检测CIDEa在干奶期和不同泌乳时期乳腺组织中的表达。结果表明:通过克隆测序得到奶山羊CIDEa基因CDS区660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank公布的绵羊、牛、人和猪的核苷酸序列同源性分别为99%、96%、85%、85%。奶山羊CIDEa蛋白属于碱性、不稳定亲水蛋白,不存在跨膜结构和信号肽;蛋白主要定位在细胞质、线粒体和细胞核。CIDEa蛋白结构主要由α螺旋、β折叠和不规则卷曲组成。奶山羊CIDEa在泌乳前期、盛期和中期乳腺组织中表达量均显著高于干奶期(P<0.05)。说明CIDEa可能参与奶山羊乳腺的泌乳过程,为进一步研究其在奶山羊乳腺组织中的功能及对乳品质的调控作用奠定基础。     

奶山羊短链脂肪酸受体GPR41基因的克隆及组织表达分析

旨在克隆奶山羊GPR41(G protein-coupled receptor 41)基因并分析其组织表达谱,为进一步探讨其功能奠定基础.根据GenBank上已登录的牛、人和鼠的GPR41基因序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法克隆奶山羊GPR41基因,利用实时荧光定量PCR方法分析奶山羊GPR41 mRNA表达的组织特异性.测序结果表明奶山羊GPR41基因的CDS区为978 bp,共编码325个氨基酸.奶山羊GPR41基因序列同源性分析表明:其与牛、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为96％、78％和74％,与牛、人和鼠的氨基酸序列同源性分别为97％、76％和74％.实时荧光定量PCR分析结果表明:奶山羊GPR41基因在小肠组织中表达量最高,其次是乳腺组织,在心脏和肾脏中表达量极低.试验结果表明GPR41可能在小肠和乳腺组织中发挥着重要的生理作用.     

萨能奶山羊乳腺组织5-HTR1基因的克隆与序列分析

根据GenBank其他物种5-HT受体-1(5-HTR1)基因序列的同源序列对奶山羊5-HTR1基因设计1对克隆引物,通过奶山羊乳腺组织提取的总RNA进行RT-PCR,将PCR产物克隆、测序。结果显示,奶山羊5-HTR1基因与牛、鼠的同源性分别为97.3%和87.2%,推测的氨基酸序列信号肽为1～45aa,SapB结构域均为78～145aa,结构特征与牛、鼠的5-HT1结构特征相一致。克隆了奶山羊乳腺组织中5-HTR1基因,为进一步研究牛乳腺组织中5-HT受体基因的分布和提高其泌乳量方面提供理论基础。     

猪Myostatin同源重组载体的构建

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列设计引物,通过PCR方法扩增了猪Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1.4 kb、4.4 kb。将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%;对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建了猪的Myostatin表达Neor、Tk基因的双标记转基因载体。     

猪THRSP基因5'侧翼区序列转录调控活性的鉴定

本研究旨在对猪THRSP基因5′调控区TP526序列进行转录调控活性的鉴定,以鉴别THRSP基因调控区的功能。提取猪耳组织基因组,利用PCR技术克隆THRSP基因5′调控区TP526序列,将其插入荧光素酶报告载体中(pGL3-Basic),构建猪THRSP基因5′调控区TP526序列调控的荧光素酶报告载体(pGL3-TP526/promot-er),经PCR鉴定后,转染293T细胞,利用双报告基因检测TP526序列的启动子活性。结果显示,pGL3-TP526/promoter调控的表达载体,其萤火虫与海肾荧光素酶荧光强度之比(1.816 2±0.253 3)显著高于pGL3-Basic(0.126 7±0.020 3),呈高效表达(P<0.01)。THRSP基因5′调控区TP526序列具有启动子调控活性。     

奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及SRY基因性别鉴定

为了探索和建立奶山羊胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验用组织块培养法分离纯化得到两株奶山羊胎儿成纤维细胞系,进行细胞形态观察、生长曲线及细胞周期和倍性分析。同时根据GenBank上发布的山羊SRY基因设计合成一对PCR引物作为性别鉴定引物,另外根据山羊BLG基因序列设计一对引物作为内参引物,建立PCR反应体系对两株胎儿成纤维细胞系进行性别鉴定。结果表明,分离的胎儿成纤维细胞活力良好,可在体外快速生长、增殖、稳定培养;阳性对照和山羊胎儿成纤维细胞系2经PCR扩增得到337 bp片段和498 bp的BLG基因片段,而阴性对照和山羊胎儿成纤维细胞系1经PCR扩增得到498 bp的β-乳球蛋白基因片段。将337 bp片段和pMD19-T载体连接,构建重组载体pSRY,通过测序证明337 bp片段为SRY基因片段。这说明有337 bp扩增带的细胞系为雄性,无337 bp扩增带的细胞系为雌性。本试验为转基因奶山羊新品种的培育奠定了基础。     

抗菌肽天蚕素B基因的克隆及其在山羊乳腺中的暂态表达

根据已发表的天蚕素B的cDNA序列化学合成4务引物,以重叠延伸PCR的方法合成了真核细胞偏爱密码子编码的抗菌肽天蚕素B基因,将其克隆于pMD18-T栽体,DNA序列分析证实合成的抗菌肽基因的碱基序列与设计的序列完全一致.利用山羊-β酪蛋白基因5'侧翼调控序列和真核基因表达栽体plRES1-neo,构建抗菌肽天蚕素B的乳腺组织特异性表达载体pbCP-cpin,将该载体溶于生理盐水,注入处于泌乳期的成年母山羊乳腺组织进行暂时表达.通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌试验确定了抗菌肽天蚕素B基因在山羊乳腺中的表达和抗菌活性.本试验建立了抗菌肽天蚕素B的乳腺瞬时表达系统,为验证各调控元件以及抗菌肽基因在转基因动物乳汁中分泌表达的有效性和可行性提供了一个快速检测系统.     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术，从小鼠基因组中克隆了1．6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5’上游调控序列，经酶切和测序证实与已知序列基本一致。为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达，将此序列与报告基因CAT融合，构建了pWAP—CAT—polyA乳腺定位表达载体，脂质体包裹后，经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达。分别于家兔分娩后1—10d采奶，用ELISA检测乳汁中CAT含量。结果表明，所构建的载体在家兔乳腺中能够表达，表达水平在家兔分娩后1—5d较高。