家蚕血细胞对病原微生物吞噬作用的扫描电镜观察

为探讨家蚕血细胞的吞噬作用,对蚕体腔分别注射微粒子孢子M_(1 2)和核多角体,经30min、1h、2h后,用相差显微镜及扫描电镜进行观察。家蚕血细胞对微粒子M_(1 2)孢子及核多角体的捕食作用,主要为颗粒细胞,其吞噬作用较之其他血细胞显著,家蚕血细胞对微粒子及核多角体的吞噬作用主要为膜捕捉(active en-membranosis),注射病原微生物30min后,可观察到多数的颗粒细胞已在捕食病原微生物;经2h后,多数的颗粒细胞已吞噬了数个甚至10数个病原微生物。     

外源激素对家蚕体内血球数的影响

家蚕幼虫血淋巴所含的血球有5种类型,即原白血球、浆细胞、颗粒细胞、小球细胞和拟绛色细胞.一般认为原白细胞和浆细胞由造血器官直接产生,而其它3种血球是由这两种血细胞通过分裂和分化形成的.     

家蚕血细胞系BmHc对脂多糖(LPS)和20-羟蜕皮酮(20E)的敏感性

为研究家蚕的细胞信号转导及外源基因在家蚕血细胞中的表达,用TC-199培养基建立起一个血细胞系BmHc。BmHc细胞系由原血球、小球细胞、颗粒细胞和浆细胞等血细胞组成,细胞倍增时间约30 h。脂多糖(LPS)刺激血细胞合成抗菌蛋白和多肽,启动细胞吸收Ca2+参与细胞的增殖。用Flu-3 AM处理细胞30 min并结合TCS-SP2激光共聚焦扫描显微镜技术对Ca2+的分布、定位进行研究的结果表明,Ca2+主要分布在原血球和颗粒细胞的膜表面,但有部分荧光分布深入到原血细胞核,显示细胞核参与了钙信号的转导途径。同等条件下,用20羟蜕皮酮(20E)处理仅可见轻微的荧光反应。LPS激发并打开了细胞膜上的Ca2+通道,引起细胞内Ca2+浓度的变化。在培养基内加入20E引起的Ca2+浓度变化相对较小,因此,20E不是细胞膜上Ca2+通道的有效激发剂。     

家蚕中肠上皮细胞增殖和分化的初步研究

通过分析家蚕自幼虫期到蛹期发育过程中肠上皮细胞的增殖与分化情况,鉴定家蚕中肠干细胞的潜在定位。采用苏木精和伊红(Hematoxylin and Eosin,H&E)染色与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色追踪变态和发育时期家蚕中肠的形态结构及细胞组成变化,结果显示,幼虫经历蜕皮及变态时,中肠形态结构以及中肠上皮细胞组成均发生明显变化:在幼虫每个龄期的盛食期肠壁较薄,眠前期(蜕皮前)明显变厚,至眠期其厚度达到峰值;中肠上皮层存在柱状细胞(CC)、杯状细胞(GC)和再生细胞(RC)3种细胞,3种类型细胞随龄期逐渐增多,其中各龄期柱状细胞持续增多,至眠期达到峰值,靠近基底膜的小细胞在眠前期增多。利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)和磷酸化组蛋白(Phospho-histone H3,PHH3)免疫荧光染色检测到中肠上皮细胞,尤其是中肠上皮层靠近基底膜处的小细胞在幼虫各龄眠前期的增殖率最高。同时通过BrdU滞留标记实验在中肠上皮层靠近基底膜处发现了BrdU滞留阳性信号。研究结果发现家蚕幼虫蜕皮时中肠上皮层靠近基底膜处的小细胞发生快速增殖,推测这些小细胞中存在着潜在的家蚕中肠干细胞。     

对乙酰氨基酚在家蚕体内的糖基化代谢特点和对组织的损伤作用

以临床解热镇痛药基本成分对乙酰氨基酚(APAP)为模药,调查APAP在家蚕体内的代谢和对蚕体主要组织(系统)的损伤以及蚕体主要解毒酶基因的表达变化,探讨家蚕作为肝毒性药物毒理研究替代实验动物的可能性。家蚕5龄2 d幼虫经口给予APAP后0.5 h,在消化管、脂肪体和血淋巴中均能够检测到原药,APAP主要糖基化解毒代谢途径中的关键酶——尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)活性也随即快速上升,其中脂肪体中的UGT酶活性上升早于血淋巴和消化管。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示,幼虫消化管和脂肪体细胞中UGT家族基因Ugt30、Ugt86和Ugt89的转录水平在给予APAP后0.5 h开始显著上调。HE染色显示,高剂量APAP对蚕体消化管和脂肪体组织具有损伤作用,但AO/PI染色未发现血淋巴中死细胞增多。研究结果表明,家蚕的消化管、脂肪体和血淋巴都有通过糖基化代谢APAP的解毒功能,过量的APAP对消化管和脂肪体组织都有损伤作用。     

南美白对虾血细胞中酚氧化酶原系统的激活

研究了不同化合物对南美白对虾血细胞溶解上清液(HLS)中酚氧化酶原激活系统(proPO系统)的激活效果和proPO系统在血淋巴中的定位问题.结果表明,南美白对虾存在于颗粒细胞中的proPO系统,可以被多种化合物激活,其中LPS和SDS的激活作用最强,lalTlinarin、zymosan A、β-1,3-1,6-glucan和peptide的激活效果次之,Trpsin的激活效果最差,Ca2+和Mg2+对proPo系统都有激活作用,随着Ca2+浓度的不断增加,Ca2+的激活作用不断增强,而Mg2+在1OO mmol/L时激活作用最强,当浓度再继续增大时反而起到抑制作用,EDTA可以显著抑制proPO系统的激活.细胞化学染色观察表明proP0系统存在于血淋巴的颗粒细胞中.     

猪卵巢颗粒细胞分离培养及鉴定

为构建猪卵巢颗粒细胞的体外培养体系,研究毒素的生殖毒性奠定基础,采用机械分离法从1～5 mm的卵泡中提取猪卵巢颗粒细胞,苔盼蓝染色计算细胞存活率,Giemsa染色和结晶紫染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色方法检测促卵泡刺激素受体(FSHR)表达来鉴定颗粒细胞,MTT方法测定细胞生长曲线.结果显示分离提取的猪卵巢颗粒细胞存活率为65%左右,细胞纯度＞97%,细胞结构完整,边缘分明,胞核呈卵圆形位于靠近胞质的中央.另外细胞生长曲线表明,细胞从24 h开始进入对数生长期,并于96 h达到最高密度,之后进入平台期.分离培养的颗粒细胞生长状态良好,且细胞纯度＞97%,是理想的适合进行毒素生殖毒理学的细胞培养体系.     

Kit和KitL在卵泡发育过程中的作用

在卵泡内,卵母细胞及其周围的颗粒细胞之间的旁分泌作用对哺乳动物的卵子发生和卵泡发育是非常重要的。研究表明颗粒细胞衍生的KitL(Kitligand,stem cell factor,SCF)与卵母细胞和膜细胞产生的Kit的相互作用在PGCs迁移和增殖、卵泡发育过程中有重要的作用。本文重点阐述了由KitL通过Kit激活的PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase,磷脂酰肌醇-3-激酶)通路,它对卵母细胞生长、凋亡和卵泡早期发育起重要的调节作用。     

应用荧光染色剂Fluorescent Brightener 28和Propidium Iodide染色识别家蚕微孢子虫

家蚕微粒子病被列为蚕种生产的唯一法定检疫对象,母蛾镜检家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)是主要的检疫方法,但其准确性受到多种因素影响。为探究应用荧光增白剂28(Fluorescent Brightener 28,FB28)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色识别Nb孢子的可行性,以感染Nb的家蚕幼虫中肠、蚕卵、母蛾、蚁蚕为材料,联合应用以上2种荧光染色剂进行Nb孢子检测效果试验。在荧光显微镜下可见成熟的Nb孢子被FB28染成蓝色且细胞核被PI染成红色,而未成熟的孢子只能被PI染色。采用2种荧光染色剂染色,在被感染的幼虫中肠、蚕卵、母蛾、蚁蚕中都能够检测到Nb孢子,并且带毒母蛾研磨液样品稀释1 000倍依然可以检测到Nb孢子。幼虫中肠感染后1~2 d很难观察到Nb孢子,感染后3 d可以观察到局部存在少量未成熟的Nb,感染后4 d开始局部出现成熟的Nb,至感染后5~6 d可见组织中大面积分布有成熟孢子和未成熟孢子。荧光显微镜下观察被染色的Nb孢子的细胞核明显小于幼虫中肠细胞核,且亮度明显较强,卵壳、母蛾、蚁蚕表面的几丁质碎片形状与Nb孢子明显不同,并且不能被PI染色。试验结果表明,该染色检测方法可以排除蚕体组织细胞、几丁质碎片的干扰,提高对Nb检测的准确度,并且在Nb浓度较低的情况下,可以提高检测的灵敏度。     

姜黄素单独及联合顺铂对人卵巢癌细胞株3AO,SKOV3增殖的影响

目的:检测姜黄素与顺铂单独及联合作用对SKOV3、3AO细胞体外生长的影响,为寻找最大程度提高卵巢癌细胞化疗敏感性的新的联合化疗方案提供实验依据。研究方法:(1)人卵巢癌细胞株SKOV3、3AO培养;(2)MTT法测定顺铂及姜黄素单独及联合作用于卵巢癌细胞系SKOV3、3AO后对细胞增殖的影响。研究结果:(1)MTT检测姜黄素与顺铂对SKOV3、3AO细胞的增殖抑制率分别随作用浓度的上升及作用时间的延长而增加;(3)MTT检测不同浓度的姜黄素(20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml)联合不同浓度的顺铂(1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml)分别作用于SKOV3、3AO细胞,细胞的生长抑制率随浓度的上升及时间的延长而增加,金氏公式分析两药联合作用具有协同效应;结论:姜黄素抑制人卵巢癌SKOV3、3AO细胞增殖的作用在一定的浓度范围内呈明显的时间-剂量依赖关系,姜黄素和顺铂联合应用对人卵巢癌细胞SKOV3、3AO的抑制作用增强,具有协同效应。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。     

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。     

中国野桑蚕Giemsa淡染性染色体的研究

对来自重庆、陕西、湖北等 3个不同地域的野桑蚕染色体进行了研究 ,结果表明 3个不同地域的野桑蚕染色体数目都为n =2 8,2n =5 6 ;均在粗线期染色体观察到了与家蚕类似的Giemsa淡染性区域 ,并对其进行了组型分析 ,从细胞遗传学的角度探讨了野桑蚕与家蚕的亲缘关系。     

猪水肿病大肠杆菌贵州分离株毒素Stx2e对Vero细胞的毒性作用

猪水肿病毒素即Ⅱ型志贺毒素变异体e亚型(Shiga toxin 2e,Stx2e)。采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,比较了从患水肿病猪粪便样品中分离的28株大肠杆菌所产志贺毒素对Vero细胞的毒性作用。结果显示,MTT比色法检测的细胞比活力与AO/EB染色法检测的正常细胞与早期凋亡细胞比率之和呈正相关。将28株菌株产生的Stx2e作用于Vero细胞,均能抑制Vero细胞的生长,并诱导Vero细胞的凋亡;其中8株病原菌所产Stx2e毒素对Vero细胞的毒性作用强于O157∶H7。这些毒素的毒力差异可能与其A亚基基因的结构变异有关。结果提示,贵州分离的产Stx2e大肠杆菌的毒力存在一定差异,其中部分菌株的毒力作用较强,应加强对养殖场仔猪的保护。     

AO/EB双重染色法检测紫杉醇体外诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡

以体外培养犬乳腺肿瘤系CHMm株为模型,用0.1μmol/L的紫杉醇对细胞处理后,用台盼蓝排斥实验和MTT法检测细胞活性,AO/EB双荧光染色荧光显微镜下观察犬乳腺肿瘤细胞凋亡及形态学变化.结果显示,紫杉醇作用后,CHMm细胞生长受到不同程度的抑制,并引起细胞凋亡,出现典型的凋亡形态.表明紫杉醇能抑制CHMm生长,引起...     

中国野蚕染色体结构及其变异的研究

采用细胞生物学的电离辐射方法研究了中国野蚕染色体形态和结构变异。结果表明 :中国野蚕 2 8条染色体粗线期大小在 1～ 3 μm之间 ,而且变异范围小 ,在生物界属于小染色体类。在电离辐射作用下 ,野蚕染色体结构异常的表现主要为易位、缺失、倒位等 ,其中易位的类型为相互易位和简单易位 ;缺失的类型为中间缺失和顶端缺失。本文从染色体变异角度对蚕的起源与分化作了探讨     

利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染

尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp基因的读码框,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中,获得重组杆状病毒BmNPV-rfp。对家蚕细胞的感染表明,rfp适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。BmNPV-rfp和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp的家蚕重组杆状病毒BmNPV-gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。BmNPV-rfp、BmN-PV-gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示AcNPV可以协助BmNPV来源的病毒基因在Sf21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。     

宿主域扩大的苜蓿尺蠖核多角体杂交型病毒

将家蚕核型多角体病毒 (BombyxmoriNuclearPolyhedrosisVirus,BmNPV)的解链酶基因DNA和苜蓿尺蠖核型多角体病毒 (AutographacalifonicaMultipleNuclearPolyhedrosisVirus,AcMNPV)的基因组DNA共转染到秋粘虫细胞系Sf 2 1,经过累代的筛选获得既能感染家蚕细胞 ,又能感染秋粘虫细胞的宿主域扩大的杂交型病毒HyNPV。     

日本血吸虫中国大陆株Sj23抗原基因在家蚕细胞中的表达及鉴定

将日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白 (Sj2 3抗原 )基因从原核表达载体 p ET2 8(c)中亚克隆入转移载体 p Bac PAK- His1,构建了 p Bac PAK- his1- Sj2 3转移载体 ,并与线性化家蚕杆状病毒共转染家蚕细胞 ;经 PCR鉴定得到重组病毒 ,经过蓝、白斑筛选得到纯化的重组病毒 ;SDS- PAGE显示日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白基因在家蚕细胞中实现表达 ,蛋白的相对分子质量为 2 6 0 0 0 ;重组 Sj2 3经 Western- Blot鉴定能够识别血吸虫感染多克隆兔血清