玉米幼苗根、茎、叶总蛋白质双向电泳方法的优化

利用改进的三氯乙酸/丙酮法对5叶期玉米根、茎、叶的总蛋白质进行双向电泳获得了高分辨率的电泳图谱。在等电点4～7范围内,根、茎、叶电泳图谱上的蛋白质点数分别为1100±89、1275±72和1327±98个。3个器官蛋白质点的分布在分子量25～75 kD和等电点5～6的范围内相对集中。通过优化样品的清洗程序结合对蛋白质在丙酮水化液中的2次沉淀能够较好地除去样品中的杂质而保证电泳质量。优化后的方法可用于玉米幼苗的根、茎、叶总蛋白质双向电泳的试验研究。     

氮胁迫条件下稻瘟病菌分泌蛋白与水稻悬浮细胞互作中“活性氧”变化分析

以CH-63和TH-16 2个致病性差异显著的稻瘟病菌株为材料,在氮胁迫培养条件下进行液体培养,经培养2d后,采用铵盐沉淀及透析纯化提取稻瘟病菌培养滤液中的致病性分泌蛋白.以24个IRRI水稻抗稻瘟病单基因系和普感品种丽江新团黑谷(LTH)的成熟种胚为材料,诱导愈伤组织并构建水稻悬浮细胞系.以构建成功的感病品种LTH和抗病品种IRBL-9的水稻悬浮细胞系为材料,接种稻瘟病菌致病性分泌蛋白并对活性氧浓度变化进行检测.结果表明,感病与抗病品种在接种前12 h均出现活性氧迸发,且均出现2个峰值.比较稻瘟病菌株TH-16和CH-63分泌蛋白接种IRBL-9与LTH后H2O2浓度变化特征,发现分泌蛋白致病性强弱与H2O2浓度变化呈正相关,CH-63产生的强致病性分泌蛋白引起活性氧浓度的快速增加.TH-16产生的弱致病性分泌蛋白接种IRBL-9与LTH后活性氧浓度则增加不明显.上述研究对于深入了解稻瘟病菌与水稻之间的相互识别、信号传导和应答过程,阐明水稻对稻瘟病菌的抗性机制、水稻与稻瘟病菌互作的分子机理具有重要意义.     

成年态柑橘离体植株中特异表达蛋白的初步研究

利用SDS-PAGE技术分析了不同培养时期成年态柑橘鱼橙离体植株中蛋白质的变化动态.结果表明,组织培养初期.总蛋白表达量略有降低,之后逐渐升高并趋于稳定.分子量约为21 kDa和31 kDa的蛋白在继代培养至第2次时,表达量开始增加,其中前者仅在柑橘离体植株中特异表达.通过改进的透析袋电洗脱法对分子量约21 kDa的蛋白回收纯化后利用质谱进行初步鉴定.结果显示,该特异表达蛋白与数据库中报道的蛋白同源性均低于50%,因此推测该蛋白属功能未知的新蛋白,其在柑橘组织培养过程中的作用有待于进一步研究.     

氮胁迫条件下稻瘟病菌菌丝体蛋白质组学研究

采用改进的三氯乙酸/丙酮法,对稻瘟病菌菌丝体蛋白质进行双向电泳,获得了高分辨率电泳图谱,较改进前三氯乙酸/丙酮法蛋白质点数量平均提高687个点。在等电点pI 3～10和4～7范围内,电泳图谱上可分别检测到(500±40)及(984±70)个蛋白点。利用该方法对氮胁迫条件下稻瘟病菌菌丝体蛋白质进行双向电泳,在pI 4～7范围内电泳图谱上检测到(1 169±90)个蛋白点。通过加强对样品的清洗结合丙酮对蛋白质在水化液中的二次沉淀,能较好地除去样品中杂质而保证电泳质量。优化后的方法可用于稻瘟病菌菌丝体蛋白质组的研究,并获得了更加理想的效果。     

棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因克隆、序列及表达谱分析

植物的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物的抵抗疾病机制中起着重要作用,能够高效、专一的结合病原体侵染时分泌的多聚半乳糖醛酸酶,抑制其活性。克隆了棉花(苏棉9号)的一段长993bpPGIP基因,命名为GhPGIP1,它能够编码一段长330个氨基酸残基,分子量与等电点分别为37.0kDa与8.30的蛋白质。核酸和蛋白质序列与其他9个物种的同源性分别为65.6%～70.3%和63.4%～68.6%。蛋白GhPGIP1有10个N端、C端半胱氨酸残基,6个可能的N糖基化位点和5个保守的亮氨酸重复结构域(LRR)。在所有的保守LRR域中,L是高度保守的。半定量RT-PCR试验结果显示,GhPGIP1在棉花的根、茎、叶中均表达,其中以叶中表达量最多。     

鸡白细胞介素-2基因在Pichia methanolica酵母中的表达

鸡白细胞介素-2(chIL-2)是近年来新发现的一种禽类细胞因子.为建立用甲醇型酵母Pichia methanolica (P. methanolica)表达鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)的新途径,将chIL-2基因插入到P. methanolica分泌型表达载体pMETαA构建了重组PMAD11表达菌株(pMETαA/rchIL-2).经SDS-PAGE、Western印迹测定,证实chIL-2基因在P. methanolica中表达成功,rchIL-2的分子量约为16 kDa,其表达量占分泌总蛋白的35%.     

苏云金芽胞杆菌cry1Ib6基因的克隆、表达及活性的研究

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)能产生杀虫晶体蛋白(Insecticida Crystal Proteins, ICPs),对敏感昆虫有强烈毒性,而对高等动物和人无毒性。ICPs由cry或cyt基因编码,根据cry1I型基因设计引物,以Bt LB52菌株的质粒DNA为模板,扩增出了全长为2.1 kb的cry1I基因,其能通过表达载体pEB在大肠杆菌中高效表达为79.9 kDa的蛋白。经过AlginX软件分析该蛋白由712个氨基酸组成,分子量为79.9 kDa,等电点为6.54,为弱酸性蛋白质,NCBI Blast比对该蛋白的氨基酸序列与Cry1Ib3的相似性最高为98%,有12个氨基酸的差异。该基因已在GenBank中注册,登录号为ADK38579,并被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ib6。它的表达产物对小菜蛾具有较高的毒力,LC50为1.196 μg/mL,为抗虫转基因植物研究提供了新的基因。     

苹果砧木M26试管苗不定根发育过程中蛋白质的变化

为进一步了解木本植物不定根发生、发育的机理,对苹果砧木M26试管苗不定根的发生、发育过程进行解剖观察,利用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对M26试管苗在接入生根培养基前后,不同时期表达的蛋白进行了研究。结果发现:在不定根原基形成和发育的阶段性过程中,茎基部蛋白质的种类和数量出现明显差异。生根培养后,在继代苗茎基部表达的5条蛋白条带减弱或消失,其分子量分别为26.8 kDa、37kDa、40.3 kDa、43 kDa和66 kDa;明显表达了4条新的蛋白条带,其分子量分别为26 kDa、27.7 kDa、32.5 kDa、和45 kDa,同时有4条蛋白条带(38.5 kDa、42 kDa、53.2 kDa和55.5 kDa)其表达丰度提高。多种蛋白条带的消失和出现,可作为M26试管苗不定根产生的生化标志。在不定根原基逐步形成发育的同时,有3条蛋白条带的表达丰度也逐步提高,可作为不定根形成过程表达的特异标记蛋白带。     

葛根膨大相关基因表达的cDNA-AFLP分析

为从本质上揭示葛块根膨大的分子机理,将cDNA-AFLP技术运用于葛块根膨大的野生型和突变型发育过程的基因表达差异的分析,筛选出5个特异表达片段,其中野生型Y0、Y1和突变型T0、T14个成功测序,结果显示:DNA片段大小分别为384、248、241和161 bp;BLAST搜索结果表明:Y0与大豆假拟蛋白相关的未知mRNA同源性99%;Y1与罗伊乳杆菌木糖异构酶基因序列同源性95%;T0与豇豆小分子热休克蛋白mRNA序列同源性87%;T1与番茄的类胡萝卜素异构酶基因同源性98%;Y0翻译的蛋白质与拟南芥亚种赤霉素结合蛋白β-2亚基有一定同源性,Y1和T0、T1翻译的蛋白质在核酸蛋白数据库中均未搜索到同源序列。     

临床型乳房炎奶牛乳清差异蛋白质的双向电泳图谱分析

采用双向凝胶电泳技术和计算机辅助图象分析方法,对临床型乳房炎奶牛和健康奶牛的乳清蛋白质进行分析和比较,结果表明:在等电点为4~8,相对分子量为15 000-75 000 kD的区域内,临床型乳房炎奶牛乳清中有(128±8)个蛋白斑点,而健康奶牛乳清中有(122±4)个蛋白斑点.对临床型乳房炎奶牛与健康奶牛乳清蛋白质图谱匹配比较发现,有31个蛋白质点表达存在明显差异,其中乳房炎乳清中有7个蛋白点表达发生明显上调,6个蛋白点表达发生明显下调,4个蛋白点没有表达,并且乳房炎乳清新出现了10个蛋白点.     

稻瘟病菌分泌蛋白组学研究

稻瘟病菌分泌蛋白在稻瘟病菌入侵水稻过程中发挥重要作用。收集稻瘟病菌(Guy11菌株)液体培养的上清液,富集蛋白,经过烷基、还原处理和酶解后,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对酶解肽段进行分离及鉴定,利用信号肽预测工具SignalP和蛋白质亚细胞定位软件Protcomp对鉴定到的蛋白进行生物信息学预测验证。结果显示,共鉴定出30个稻瘟病菌的分泌蛋白,其中:24个蛋白具有N端信号肽,26个蛋白可分泌到胞外,3个蛋白定位在细胞膜上。对其功能进行分类,发现多数为酶类,参与水解及能量代谢。这些酶类和蛋白的发现与进一步研究,将为揭示稻瘟病菌侵染的机理提供帮助。     

苗期水稻叶片发育进程的差异蛋白质组学分析

【目的】从蛋白质组学角度对杂交水稻汕优63苗期的叶片蛋白质组变化进行研究,以揭示水稻苗期叶片蛋白质组的表达差异。【方法】蛋白质点经双向电泳得到分离,并采用Imagemaster 2D Elite 5.0软件对所得到的双向电泳图谱进行分析比较。【结果】经图谱分析共得到差异蛋白质点41个,其中三叶期后新增蛋白质点17个,包括9个仅在三叶期出现特异的特异蛋白质点,13个蛋白质点表达丰度先逐渐增强随后减弱或在消失,其它11个蛋白质点中,自二叶期开始表达丰度呈现下降的蛋白质点有3个,保持上升的有6个,不规律出现的有2个;其中的15个蛋白质点经质谱分析得到鉴定。【结论】蛋白质是细胞功能执行者,受细胞功能或细胞环境变化的影响,因此,上述蛋白质发生变化的原因可能与水稻苗期分蘖发生有关系。     

王浆高产蜜蜂(A.m.ligustica)与喀尼鄂拉蜂(A.m.carnica)幼虫期蛋白质组比较

【目的】对王浆高产蜜蜂(A. m. ligustica,浆蜂）与喀尼鄂拉蜂(A. m. carnica,喀蜂）工蜂幼虫期进行蛋白质组比较,以探明两蜂种幼虫期不同日龄蛋白质表达调控方面的异同。【方法】采用双向电泳对浆蜂与喀蜂工蜂幼虫期蛋白质组进行研究。【结果】在幼虫期2日龄,浆蜂的蛋白表达谱为283个蛋白,喀蜂为152个蛋白,两蜂种共有蛋白点为110个,其中24个点浆蜂表达量显著大于喀蜂,15个蛋白喀蜂表达量显著大于浆蜂,而浆蜂特异蛋白为173个,而喀蜂特异蛋白为42个;幼虫4日龄时,浆蜂总蛋白点数为290个,喀蜂总蛋白点数为240个蛋白,两蜂种共有蛋白点为163个,其中24个点浆蜂表达量显著大于喀蜂,15个蛋白喀蜂表达量显著大于浆蜂,而浆蜂特异蛋白为126个,喀蜂特异蛋白为77个;到达幼虫6日龄时,浆蜂蛋白组含236个蛋白,喀蜂蛋白质组含180个蛋白,两蜂种共有蛋白点为132个,其中22个点显示浆蜂表达量显著大于喀蜂,11个蛋白喀蜂表达量显著大于浆蜂,而浆蜂特异蛋白为104个,喀蜂特异蛋白为48个。【结论】在蜜蜂幼虫期浆蜂较喀蜂表达的蛋白总数和特有蛋白多,说明浆蜂较喀蜂幼虫的基因表达和代谢更加旺盛。在2蜂种幼虫期表达的共有蛋白中,其中一些蛋白的表达量存在差异,而2蜂种在3个日龄所表达的特有蛋白的数和量也存在一定差异,这些说明幼虫发育需要管家蛋白和不同发育阶段相应的特定蛋白来调控,但管家蛋白和特有蛋白在2蜂种的表达模式存在差异。     

原种意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)与其王浆高产品系工蜂蛹期头部发育差异蛋白质组分析

【目的】对原种意大利蜜蜂(意蜂)和原种意大利蜜蜂的王浆高产品系(浆蜂)工蜂蛹期头部的蛋白质组进行比较,以探明浆蜂和意蜂3个日龄(13、15、17日龄)蛋白质表达调控方面的差异,为阐明蜜蜂发育生物学提供一定理论基础。【方法】采用双向电泳建立浆蜂和意蜂3个日龄蛹期头部蛋白质组表达谱,获得图谱中蛋白质的种类、表达量、等电点和分子量等信息,并通过质谱分析、数据库检索,鉴定部分差异蛋白。【结果】在13日龄蛹头部,浆蜂表达279个蛋白,意蜂表达268个蛋白,浆蜂和意蜂共有蛋白为212个,而浆蜂和意蜂的特异蛋白分别为67个和56个;到15日龄时,浆蜂表达296个蛋白,意蜂为277个,浆蜂和意蜂共有蛋白点为203个,浆蜂特异蛋白点为93个,意蜂特异蛋白点为74个;到17日龄蛹时,浆蜂蛋白质组有340个蛋白点,而意蜂则有279个蛋白点,浆蜂和意蜂共有蛋白点为246个,浆蜂的特异蛋白点为94个,意蜂特异蛋白点为33个。对部分差异蛋白质进行质谱分析后,鉴定出11个蛋白质。对已鉴定蛋白质表达量聚类分析,结果聚为2类:表达量上调的分别是微管蛋白、肌动蛋白88F、ATP合成酶、谷胱甘肽S-转移酶S1、精氨酸激酶、热激蛋白、蛋白酶体2亚基、泡液ATP合成酶催化亚基和转录起始因子5A;表达量下调的蛋白质为过氧化物氧化还原酶2540。【结论】浆蜂经过蜂王浆高产的选育,表达的蛋白质种类比意蜂增加。随着日龄的增长,大多数与细胞骨架、抗氧化相关和代谢相关的蛋白质显著上调表达,表明工蜂蛹头部的王浆腺和唾液腺等组织在生长发育,新陈代谢加强以及神经系统逐渐重塑。这将对全面理解浆蜂和意蜂蛹期发育规律奠定基础。     

原种意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）与其王浆高产品系工蜂蛹期头部发育差异蛋白质组分析#br#

【目的】对原种意大利蜜蜂（意蜂）和原种意大利蜜蜂的王浆高产品系（浆蜂）工蜂蛹期头部的蛋白质组进行比较,以探明浆蜂和意蜂3个日龄（13、15、17日龄）蛋白质表达调控方面的差异,为阐明蜜蜂发育生物学提供一定理论基础。【方法】采用双向电泳建立浆蜂和意蜂3个日龄蛹期头部蛋白质组表达谱,获得图谱中蛋白质的种类、表达量、等电点和分子量等信息,并通过质谱分析、数据库检索,鉴定部分差异蛋白。【结果】在13日龄蛹头部,浆蜂表达279个蛋白,意蜂表达268个蛋白,浆蜂和意蜂共有蛋白为212个,而浆蜂和意蜂的特异蛋白分别为67个和56个;到15日龄时,浆蜂表达296个蛋白,意蜂为277个,浆蜂和意蜂共有蛋白点为203个,浆蜂特异蛋白点为93个,意蜂特异蛋白点为74个;到17日龄蛹时,浆蜂蛋白质组有340个蛋白点,而意蜂则有279个蛋白点,浆蜂和意蜂共有蛋白点为246个,浆蜂的特异蛋白点为94个,意蜂特异蛋白点为33个。对部分差异蛋白质进行质谱分析后,鉴定出11个蛋白质。对已鉴定蛋白质表达量聚类分析,结果聚为2类：表达量上调的分别是微管蛋白、肌动蛋白88F、ATP合成酶、谷胱甘肽S-转移酶S1、精氨酸激酶、热激蛋白、蛋白酶体2亚基、泡液ATP合成酶催化亚基和转录起始因子5A;表达量下调的蛋白质为过氧化物氧化还原酶2 540。【结论】浆蜂经过蜂王浆高产的选育,表达的蛋白质种类比意蜂增加。随着日龄的增长,大多数与细胞骨架、抗氧化相关和代谢相关的蛋白质显著上调表达,表明工蜂蛹头部的王浆腺和唾液腺等组织在生长发育,新陈代谢加强以及神经系统逐渐重塑。这将对全面理解浆蜂和意蜂蛹期发育规律奠定基础。     

地肤子提取物毒杀螨的蛋白组双向电泳分析

山楂叶螨是一种世界性的重要害螨,地肤子提取物对其有很好的杀螨活性。本文通过2-DE技术分析了1mg·mL-1地肤子提取物处理后山楂叶螨蛋白质表达的变化。结果表明,处理组和对照的蛋白双向电泳银染图谱Pattern非常相似,对照胶和处理胶平均匹配率分别为43.8%和42.3%,对照胶有蛋白点1139±102个,处理胶有蛋白点1183±106个,这些蛋白多数集中于等电点5.0~9.0之间,分子量20~70ku的区域。通过PD-QUEST软件搜索和数据的统计分析,发现地肤子提取物触杀山楂叶螨会引起蛋白显著性变化(P0.05)。有262±23个蛋白点在表达量上有显著变化,其中142±13个点是2倍上调的点,另外120±11个点是下调的点,介于两者之间的点有237±21个。同时处理胶增加322±29个蛋白点,分子量主要集中在30~70ku,等电点集中在pH(5~6)和pH(7.5~9.0)之间。并推断试验中显著性变化的蛋白有可能是地肤子提取物的靶标蛋白。     

蜜蜂（Apis mellifera L.）幼虫级型分化差异蛋白质组分析

【目的】对蜜蜂（Apis mellifera L.）蜂王与工蜂级型分化期的蛋白质组进行比较,以探明蜂王和工蜂在级型分化时期蛋白质表达调控方面的异同。【方法】采用双向电泳建立蜂王和工蜂级型分化期蛋白质组表达 谱,获得图谱中蛋白质表达的数量、表达量、等电点和分子量等信息,然后进行比较蛋白质组研究。【结果】在幼虫3日龄,蜂王表达288个蛋白质,工蜂表达259个蛋白质,2种级型蜂共有蛋白质为156个,其中25个蛋白质在蜂王中的表达量显著大于（P＜0.05）工蜂,34个蛋白质工蜂表达量显著大于（P＜0.05）蜂王,而蜂王和工蜂的特异蛋白质分别为132个和103个;到幼虫5日龄时,蜂王表达274个蛋白质,工蜂为236个,这2种级型蜂共有蛋白质点为95个,其中蜂王15个蛋白质的表达量显著大于（P＜0.05）工蜂,工蜂26个蛋白质的表达量显著大于（P＜0.05）蜂王,而蜂王特异蛋白质点为179个,工蜂特异蛋白质点为141个;到蛹11日龄时,蜂王蛋白质组有311个蛋白质点,而工蜂则有278个蛋白质点,2种蜂共有蛋白质点为194个,其中蜂王45个蛋白质的表达量显著大于（P＜0.05）工蜂,工蜂35个蛋白质的表达量显著大于（P＜0.05）蜂王,而蜂王的特异蛋白质点为117个,工蜂特异蛋白质点为84个。【结论】在蜜蜂3日龄、5日龄、11日龄时,蜂王和工蜂的蛋白质表达谱存在显著差异,蜂王表达的蛋白质总数和特有蛋白质数都较工蜂多,说明蜂王幼虫的基因表达和代谢比工蜂幼虫更加旺盛。2种级型蜂发育中所表达的共有蛋白质可能是它们发育所必须的管家蛋白质,但级型间部分共有蛋白质的表达模式存在较大差异,在3个日龄中蜂王和工蜂中所表达的特异蛋白质表明在级型分化中,不同级型需要不同的蛋白质来调节各自的发育。这些特异蛋白质是否是级型发育相关的功能蛋白质,还有待进一步的研究。     

与黄花马蹄莲互作过程中胡萝卜软腐果胶杆菌的差异表达蛋白分析

通过病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种与黄花马蹄莲组织的离体互作,运用双向电泳技术、质谱技术及Im-ageMaster 2D platinum 5.0(GE)软件对互作过程中蛋白质差异表达进行分析。结果表明:70个蛋白点在互作中存在表达差异,占蛋白点总数的18.13%。通过质谱分析发现:2个特异表达蛋白分子伴侣DnaK和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)均为代谢类蛋白;3个显著上调表达蛋白中ATP合酶α亚基和半胱氨酸合酶为代谢类蛋白,而β-内酰胺酶为抗生素类蛋白。     

甜高粱WRKY转录因子基因的克隆与表达分析

【目的】克隆甜高粱WRKY基因,分析其序列特征和表达谱,为甜高粱抗旱育种提供基因来源。【方法】以甜高粱品种M81-E幼苗总RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆甜高粱WRKY基因,通过生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR检测基因表达情况,获得2条WRKY基因,命名为SbWRKY1(Genebank登录号:KY231904)和SbWRKY2(Genebank登录号:KY231905)。【结果】SbWRKY1 cDNA序列全长1086 bp,包括1个1059 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸。SbWRKY2 cDNA序列全长750 bp,包括1个717 bp的开放阅读框,编码238个氨基酸。2个基因编码的蛋白均具有WRKY核心序列"WRKYGQK"和"C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H"锌指结构模型。SbWRKY1蛋白分子式为C_(1628)H_(2619)N_(509)O_(504)S_(16),预测蛋白质分子量为37.89 kDa,等电点(PI)为9.78。SbWRKY2蛋白分子式为C_(1131)H_(1752)N_(326)O_(344)S_(21),预测蛋白质分子量为26.09 kDa,等电点(PI)为8.43。系统进化树分析表明,SbWRKY1蛋白与高粱、玉米和谷子WRKY蛋白亲缘关系较近,SbWRKY2蛋白与高粱、芒草和玉米WRKY蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,随着干旱胁迫时间延长,SbWRKY1和SbWRKY2呈上调表达趋势。【结论】SbWRKY1和SbWRKY2基因可能在甜高粱应对干旱胁迫中发挥一定作用。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia32基因克隆和原核表达的研究

根据GenBank中cry1I类基因序列设计特异性引物,以Bt SC-13菌总DNA为模板PCR扩增得到2 151bp的cry1Ia全长基因。该基因编码蛋白由717个氨基酸组成,相对分子量为80.9kDa,等电点为6.57,编码蛋白与Cry1Ia1(CAA44633)亲缘关系最高达99.03%的序列同源性,该蛋白被Btδ-内毒素国际命名委员会正式命名为Cry1Ia32(登录号为JX944039)。cry1Ia32基因通过表达载体pET-21b在大肠杆菌中高效表达分子量为81kDa的蛋白,诱导表达的Cry1Ia32蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾的2龄幼虫具有较高杀虫活性,LC50值分别为0.025mg/mL和0.011mg/mL,为抗虫转基因植物研究提供了新的基因。