罗非鱼海豚链球菌16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对1株致病性罗非鱼链球菌进行分类学鉴定,利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的罗非鱼致病性链球菌进行16S rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5 kp目的片段,测序得到1条长度为1 447 bp核苷酸序列。核苷酸相似性分析表明,序列与NCB I公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16SrRNA基因核苷酸序列相似性最高(99.4%),暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时,亲源关系较近的S.iniae、S.difficilis和S.agalactiae代表菌株构建的系统发育进化树显示,所得菌株与S.iniae代表菌株组成同一进化分支,与S.agalactiae代表菌株组成的另一进化分支距离较近(95.5%),而与S.difficilis代表菌株组成的进化分支距离较远(92.3%)。上述研究证实,本试验从发病罗非鱼脑组织分离到的致病性链球菌为海豚链球菌。     

罗非鱼无乳链球菌的分子鉴定

对罗非鱼致病菌株TL60829NA及其人工感染后分离菌株TL60829NA1、TL60829NA2应用原核生物16S rRNA基因通用引物进行分子分类学鉴定.对这些菌株进行16srRNA基因的克隆、序列分析,核酸序列同源性分析表明,TL60829NA及其人工感染后分离菌株TL60829NA1、TL60829NA2为同一种细菌.其中,TL60829NA2与GenBank登陆号为DQ303183的无乳链球菌(Streptococcus agalaciate)菌株ATCC13813序列同源性最高(99.8%).同时,通过与常引起罗非鱼链球菌病的S.agalaciate、S.iniae代表菌株16srRNA基因构建的发育进化树表明,该菌株及其人工感染后分离菌株与S.agalaciate代表菌株构成一个进化分枝,而4株S.iniae代表菌株的16srRNA基因则构成另一个分枝.本研究证实了从发病罗非鱼肝脏组织中分离到的致病性链球菌为无乳链球菌.     

罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究

从患暴发性流行病罗非鱼的肝脏中分离获得一株细菌TL60829NA,将TL60829NA对罗非鱼进行人工感染致病性试验,试验感染罗非鱼表现出自然发病症状,确认分离菌株为罗非鱼暴发性流行病的致病菌.分离株菌经形态学观察、Bio Merieux Vitek全自动微生物分析系统GPI测定卡分析和16S rRNA特异性基因序列与NCBI中收录的其它引起罗非鱼病害的链球菌的16S rDNA序列构建的系统发育进化树显示,分离细菌与其它无乳链球菌的16S rDNA序列构成一个进化分支,而海豚链球菌则构成另一分支,确定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalaciate).分离菌株对氨苄西林、青霉素G、卡那霉素等28种试验药物敏感,对妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星等15种试验药物不敏感.由无乳链球菌引起的罗非鱼暴发性流行病的主要病理变化为鳃小片结构崩解,鳃上皮增生、融合;心肌纤维变性、肌间白细胞浸润;肝脏颗粒变性和脂肪变性;肠道粘膜上皮变性、坏死、脱落、固有膜炎性白细胞浸润;肾脏组织大量嗜中性白细胞浸润,肾小管上皮细胞核固缩,小动脉血管壁玻璃样变性;眼睛的脉络膜和眶骨膜组织炎性坏死,晶状体纤维断裂和脱离.     

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006~2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006~2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析。结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)其余57株鉴定为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)。2006~2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7%),仅1株无乳链球菌;2009~2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6%),仅2株海豚链球菌。PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度在83.9%~100%之间;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度在47.4%~100%之间。研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009~2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性。     

西伯利亚鲟海豚链球菌的分离鉴定及毒力基因检测

2013年8-9月,四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜囊肿为特征的传染病.为明确其病因,本研究从自然发病鱼的肝、脾和肾进行了病原菌的分离、人工感染、分离菌的表型特征和分子生物学特征的检测.结果从患病鱼体内分离到一株G+链状球菌(Ab130920),人工感染实验证实了其病原性,生理生化特性与海豚链球菌(ATCC29178)基本一致;16S rDNA序列(GenBank登录号:KJ162337)与GenBank中S.iniae 16S rDNA序列同源性最高,在以16S rDNA序列及其GenBank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上,分离菌与海豚链球菌聚为一支;同时,在基于S.iniae lctO基因的特异性PCR检测中,从分离株基因组DNA扩增出预期大小的870 bp条带,进而鉴定分离菌Ab130920为S.iniae.在对cpsD、simA、sagA、pdi和scpI等5种S.iniae毒力基因的多重PCR检测中,分离菌均扩增出相应大小的特异性片段,表明其为一毒力较强的菌株,与人工感染实验的高致病性结果相佐证;药物敏感性检测发现其对阿莫西林、强力霉素、氟苯尼考等抗菌药物敏感,但对新生霉素、利福平、氧氟沙星耐药.     

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006-2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006-2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析.结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌其余57株鉴定为无乳链球菌.2006-2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7％),仅1株无乳链球菌;2009-2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6％),仅2株海豚链球菌.PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度为83.9％～100％;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度为47.4％～100％.研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009-2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性.     

斑点叉尾鮰暴发海豚链球菌病的研究

2006—2007连续两年广西斑点叉尾鮰网箱养殖暴发一种流行性传染病,该病波及面广,传染性强,死亡率30％～100％。发病症状主要表现为浮头、转圈、狂游及发病后期单边眼睛浑浊、突出及伴有全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型发病班点叉尾鮰分离到CMS003～CMS005、CMS009～CMS012共7株代表性菌株,经人工感染实验表明分离菌株对健康斑点叉尾鮰具有很强的致病力,出现症状与自然发病斑点叉尾鮰症状相同。通过常规形态、生理生化及海豚链球菌（Streptococcus iniae）特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析方法对分离菌株进行分类鉴定,结果表明分离的7株细菌均为海豚链球菌。研究结果表明,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鮰网箱养殖的高致病性病原菌。     

杀鲑气单胞菌一新亚种的生物学特性及系统发育学分析

从石鲽（Kareius bicoloratus L．）细菌性败血感染症的病鱼（濒死及死亡不久）中分离到相应病原菌，进行形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中G＋Ct001％的测定。同时，选择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定，测定16S rRNA基因序列、分析相关细菌相应序列的同源性，构建系统发生树。结果表明，分离鉴定的60株菌为杀鲑气单胞菌的一个新亚种（subsp．nov．），定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种（Aeromonas salmonicida subsp．flounderacia subsp．nov．）。代表菌株HQ010320-1及HQ010320-5的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的杀鲑气单胞菌的同源性在99％和100％。     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

近年来，海豚链球病已给我国及世界罗非鱼养殖带来了巨大的经济损失。为建立特异、敏感、快速的罗非鱼海豚链球菌PCR诊断方法，根据NCBI数据库已公布的海豚链球菌基因序列，设计合成种特异性引物CM1／CM2，进行海豚链球菌特异基因片段的PCR扩增试验、反应条件的优化及不同检测材料的比较。同时测试了方法的特异性和敏感性，对不同养殖鱼场的10份临床样品进行了检测。试验结果表明，引物CM1／CM2可以扩增到与预计大小相符的870bp海豚链球菌特异性基因片段；PCR反应与鮰爱德华氏细菌、Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌和河弧菌水产常见病原菌均无交叉反应；能够检测的最低细菌数为20～30个海豚链球菌；同时，该PCR可以直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织扩增出特异性目的片段；临床菌株检测结果与基于菌株16srRNA基因序列系统进化分析结果一致。由于病鱼内脏组织总DNA、菌落及菌液可直接用于该PCR扩增，最大限度缩短了整个检测时间及降低了检测成本。方法的建立为致病性海豚链球菌检测提供了一种简便、快速的途径，具有较好的应用前景。     

6株水产动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因的克隆与序列分析

根据气单胞菌主要黏附素基因（ahal）、溶血素基因（hly）和细胞兴奋性肠毒素基因（alt）完整开放阅读框（0RF）设计3对特异性引物，对6株气单胞菌安徽分离株进行ahal、hly和alt基因的PCR扩增、克隆和测序。测序结果显示，安徽分离株aim、hly和alt基因的ORF大小分别为1056--1068bp、1482bp和1104N1107bp，各编码351-355、493和367-368个氨基酸。序列分析显示：（1）属于alt^＋aim^＋hly^＋毒力基因型的3个安徽分离株间aha1核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均很高，分别为98.8％-99．3％和97％-97．6％，且与国内参考株mh／Trionyx sinensis／Guangzhou（Guangdong）／AF276639的同源性高达98．5％-99％和96.8％-97．6％。而alt^＋ahal^＋hly^-HA6安徽分离株与国外参考株Ah／Fish／Barcelona（Spain）／AF183931间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性较高，分别为95.8％和97．2％。（2）不同表型种气单胞菌安徽分离株之间及其与国内外其他分离株之间的hly核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均较高，分别介于88．4％-100％之间和90.8％-98．7％之间。（3）5个安徽分离株（RA16、CA1、HA6、HA7和GA1）之间及其与惟一参考株之间的alt核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性分别高达93．5％-99．9％和80．2％-98．3％，但与BA17分离株间的核苷酸序列同源性（81．6％-81．7％）和推测的氨基酸序列同源性（77．5％-84．9％）均较低。这些结果表明，气单胞菌ahal和alt基因在不同毒力基因型间存在一定差异性，hly基因在不同表型种间存在较高保守性，该基因可作为研制气单胞菌基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫（Newcastle Disease，ND）抗体鸡群仍然发生新城疲（ND）的情况，应用分子流行病学技术。对所分离的18株鸡菲新城疲病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化．以SDS-蛋白酶K（或Trizol法）提取病毒RNA，RT—PCR扩增其融合蛋白（F）基因532bp或280bp关键片断，经回收克隆到pMD 18-T载体上进行核苷酸序列测定（GenBank序列号：AY208680-AY208698）。核苷酸和氧基酸序列进行同源性比较，结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83．1％-100％，氨基酸同源性为85．5％-100％；系统发育进化时分析显示．其中JL-12、HLJ-3为弱毒株．与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型；其余17株均为强毒袜．其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型，其余15株均为基因Ⅶ型，由此可见东北地区目前新城疲的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠（Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型）所发．但以基因Ⅶ型为主．速与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

广东省养殖罗非鱼、海鲈、尖吻鲈海豚链球菌感染调查

利用细菌分离培养方法结合特异PCR技术,对广东省珠三角地区养殖罗非鱼(Oreochromis spp.)、海鲈(Lateolabrax japonicus)及尖吻鲈(Lates calcarifer)的海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染情况进行了周年调查。每月固定时间在特定养殖区域采集目标鱼的脑、肝、脾、肾和肌肉等组织,并对其进行海豚链球菌的细菌分离培养鉴定。仅从已经患病的尖吻鲈中分离到3株链球菌,经生理生化鉴定和16S rDNA测序确定为海豚链球菌。利用海豚链球菌特异PCR技术对上述养殖鱼类不同组织进行检测,发现罗非鱼、海鲈、尖吻鲈的海豚链球菌感染率分别为30.21%、23.53%、14.55%,其中罗非鱼脑和肌肉的感染率明显较其他组织高(P<0.05),分别为20.65%和23.75%;海鲈的脑部和肌肉感染率也较其他组织高(P<0.05),分别为12.1%和10%;而尖吻鲈各组织感染率没有较大差异(P>0.05)。另外,研究结果还表明采集样本的海豚链球菌感染率随着其体长的增加而呈现下降趋势。     

牛蛙背部肿胀病的病原菌分离与鉴定及药敏实验

在广东广州番禺某牛蛙养殖场发现较为特殊的疾病且传染率和死亡率较高,为查明其致病原,从患病牛蛙(Rana catesbeiana)中抽取其背部的积液和对其他病变部位如肝、脾等进行细菌的分离纯化后得到两株优势菌,然后将两株优势菌进行16S rRNA基因测序、进化树构建、革兰氏染色细菌和生理生化实验进行鉴定和分析,结果显示一株菌株GPY923为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),另一株菌株GPY924为海豚链球菌(Streptococcus iniae),进行人工感染后表明其具有较强的致病性。药敏试验结果显示嗜水气单胞菌对丁胺卡那、红霉素、头孢他啶、头孢呋辛、青霉素和氟苯尼考敏感,对多种药物耐药;海豚链球菌对林可霉素和头孢呋辛耐药,对头孢他啶中度敏感,其余药物均敏感。     

西伯利亚鲟海豚链球菌和鲟疱疹病毒Ⅱ型混合感染的诊断与病理损伤

2018年8月,四川彭州与邛崃的养殖西伯利亚鲟发生一种以出血为临床特征,高死亡率的传染病,为明确其病因,本研究对发病鲟的肝脏、肾脏进行病原菌分离、鉴定和鲟疱疹病毒Ⅱ型(AciHV-2)的PCR检测。从患病鲟体内分离到2株G+链状球菌,其16S rRNA序列(MN416231、MN416230)与GenBank中海豚链球菌16S rRNA序列同源性达99%,在以16S rRNA序列构建的系统发育树上,分离菌与海豚链球菌聚为一支;同时基于海豚链球菌lctO基因的特异性PCR检测为阳性,鉴定2株分离菌为海豚链球菌。提取患病鲟肝脏、肾脏组织DNA进行AciHV-2特异性PCR检测,扩增出501 bp的特异性条带,在以AciHV-2 polymerase基因序列构建的系统发育树上,检测样本与AciHV-2聚为一支。病理组织学上,患病鲟的多组织器官发生明显损伤,尤其是肝脏、肾脏、鳃、脾脏和肠的损伤较为严重,表现为明显的变性、坏死、出血以及炎症细胞浸润;电镜下,观察到肝脏、肾脏组织内大量直径200～220 nm的疱疹病毒样颗粒与0.7～0.8μm的链球菌入侵细胞,并导致细胞损伤。综上,诊断患病西伯利亚鲟的病因是海豚链球菌与AciHV-2混合感染。     

广西卵形鲳鲹海豚链球菌基因分型、耐药谱型以及毒力基因检测

为了解近年来广西卵形鲳鲹海豚链球菌流行菌株的基因型信息以及菌株间的差异,对2015—2016年从广西地区7个养殖场的患病卵形鲳鲹体内分离得到的17株海豚链球菌菌株分别进行了基因型分析、耐药谱测定以及毒力基因检测。采用随机扩增多态性DNA标记技术(RAPD)和基因组重复序列PCR(rep-PCR)分析其基因型。结果显示,RAPD和rep-PCR指纹图谱结果一致,17株海豚链球菌可分为2种基因型。对海豚链球菌7种主要的毒力相关基因特异PCR检测,所有菌株均为sim A+scp I+pdi+sag A+cps D+pgm A+cfi+毒力基因型,表明这2种基因型的海豚链球菌似乎均为毒力较强的菌株。采用K-B法进行了20种抗生素敏感实验分析其耐药谱,结果表明归于基因1型的菌株耐药谱为AZT,基因2型菌株则出现3种相似的耐药谱,分别为SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB、SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/CRO和SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB/RIF,证实基因型相同的菌株耐药谱型也相似,2种基因型的菌株耐药谱型差异显著,因此基因型和耐药谱型存在相关性。此结果为卵形鲳鲹海豚链球菌病流行病学研究、疫苗研制以及疫病监测提供理论依据。     

无乳链球菌和海豚链球菌早期预警分子检测

为提高罗非鱼链球菌病发前的早期预警,根据海豚链球菌的16S rRNA基因的部分序列和无乳链球菌的Sip基因特异性序列,分别合成特异性检测引物,经过对反应体系和反应条件的优化,建立检测较低含量的无乳链球菌和海豚链球菌的分子技术。试验结果显示,所建立的双重PCR可扩增出870 bp无乳链球菌和614 bp海豚链球菌的特异性片段,而迟钝爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌均为阴性;无乳链球菌和海豚链球菌基因组DNA最低检测量分别为9.84×10~(-5) ng/μL和9.30×10~(-5) ng/μL,菌液最低检测量分别为2.76×10~3 cfu/mL和2.51×10~3 cfu/mL,远低于其半致死密度10~7 cfu/mL;对无乳链球菌和海豚链球菌混合感染的模拟临床样品的检出率为100%。研究结果表明,该分子技术的特异性较强、灵敏度较高、检出率较高,可用于较低含量的无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,为罗非鱼链球菌的早期预警分子检测提供技术支持。     

细胞核rDNA序列用于罗非鱼及其杂交种鉴别的初步研究

罗非鱼种间,尤其是尼罗罗非鱼与杂种尼奥罗非鱼之间,很难区分。本文对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、莫桑比克罗非鱼和杂交种尼奥罗非鱼（尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂）和红罗非鱼的核糖体DNA内部转录间隔子1（ITS1）序列及其两侧的18S和5．8s部分序列特征进行分析,以筛选种间鉴别标记。PCR扩增产物大小约700bp,测序结果表明,（去除引物后）18S长146bp,5．8S长66bp,不同种类之间无差异;ITS1长383-483bp,因种类不同而异,其GC含量大于AT含量,达到67．1％。序列比对分析结果表明,18S和5．8s片段高度保守,但各有3个变异位点可以把上述几个种和杂种相互区分开;18S序列上有一个UnbI限制性酶切位点,可作为尼罗和尼奥罗非鱼的鉴别标记。ITS1序列种间变异大,系统发育分析表明,所研究的5个种聚成2个类群,尼罗与尼奥罗非鱼为一组,莫桑比克-红罗非鱼-奥利亚罗非鱼为另一组。组内种间遗传距离较小,尼罗和尼奥罗非鱼的种间遗传距离为0．006;莫桑比克、奥利亚和红罗非鱼的种间遗传距离在0．007-0．009之间;两组罗非鱼之间的遗传距离较大,在0．030-0．035之间,表明罗非鱼ITS1序列多态性较高,适合于种类区分。结合部分18S和5．8S序列,细胞核rDNA具有鉴别罗非鱼及其杂种的潜力。     

猪圆环病毒2型分离株的基因组克隆、序列测定与分析

设计合成两对覆盖PCV2基因组奎长的引物，对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同泺性比较，并绘制系统发育进化树。结果显示。所测毒株与其它地城的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之问的奎基因核苷酸同源性在95.4％-99.3％。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个夫的分支：欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系，L属于美洲系。     

猪圆环病毒2型分离株的基因组克隆、序列测定与分析

设计合成两对覆盖PCV2基因组全长的引物,对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株与其它地域的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之间的全基因核苷酸同源性在95.4%～99.3%。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个大的分支:欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系,L属于美洲系。     

罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析

根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Aer)毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增GXL3、GXL5、GXL9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.测序结果表明,3个菌株Aer毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1 335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、91.4%、91.4%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性.应用分子生物软件分析广西分离株GXL9 Aer成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5.