丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

目的：探索不同浓度的丝裂霉素c（MMC）处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法：取13．5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论：胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;MMC能有效抑制胎儿成纤维细胞的增殖,最佳处理方法为20μg／ml、2h。妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在10、20μg／mlMMC处理的饲养层上孵出率和贴壁率显著高于5／Lg／mlMMC处理的饲养层,在5、10和20μg／m[MMC处理的饲养层上,内细胞团增殖率无显著差异。因此,ICR小鼠胚胎成纤维细胞最佳处理方法为20μg／mlMMC作用2h。     

ICR小鼠胚胎干细胞体外培养体系的优化

为了优化ICR小鼠胚胎干细胞体外培养体系,本实验以ICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5dICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了不同胚胎发育阶段、不同胰岛素添加量和不同生长因子对ICR小鼠类胚胎干细胞(mESCs)分离培养的影响。实验结果表明:囊胚期的胚胎贴壁率和内细胞团(inner cell mass,ICM)集落增殖率(82.4%、64.7%)显著高于桑葚胚期(54.2%、41.7%)(P0.05);在添加不同浓度胰岛素时,0、5、10mg/mL组的胚胎贴壁率和ICM集落增殖率差异均不显著(P0.05);添加生长因子组的胚胎贴壁率和ICM集落增殖率显著优于未添加组(P0.05),而添加组中单独添加SCF稍逊于单独添加LIF和2种因子一起添加的效果。     

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究.(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后.用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况.(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上.观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况.结果显示:囊胚在密度为1 × 106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×104/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05).结果表明:以1×104/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用.     

山羊类ES细胞的分离与克隆

采集山羊交配后6～8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞(PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后,将各自一半胚胎切割,把含ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养,另一半整胚在各自饲养层上继续培养,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当ICM增殖一定程度时进行传代,以比较其类ES细胞分离与克隆的效果。结果表明,在2种不同饲养层上,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚,囊胚的脱带率均高于桑椹胚,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在PMEF还是在PGEF饲养层上,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚,而贴壁率高于脱带整胚,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在PMEF饲养层上所获类ES细胞只能维持3代,而在PGEF饲养层上,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类ES细胞传至5代。由此认为,对脱带后的胚胎进行切割处理,有利于ICM的贴壁和增殖;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统,有利于类ES细胞的分离与克隆。     

昆明小白鼠胚胎干细胞分离培养的影响因素

为了研究影响胚胎干细胞(ESC)体外分离克隆的因素,试验采用3~5日龄大鼠心肌细胞制成心肌细胞条件培养基(RH-CM),比较了4种培养体系对小鼠胚胎干细胞体外培养的影响,并分析比较了不同饲养层对胚胎干细胞分离克隆造成的影响。结果表明:添加重组鼠白血病抑制因子和心肌细胞条件培养基在胚胎贴壁率、内细胞团(ICM)形成率和原代胚胎干细胞集落形成率以及抑制分化的过程中起到的作用显著优于未添加任何诱导成分的培养基;作为饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养胚胎干细胞的效果优于小鼠睾丸支持细胞(MS)。     

饲养层和生长因子对山羊类胚胎干细胞的影响

实验以6~8 d的山羊囊胚为实验材料,采用机械法分离山羊囊胚ICM,分别以小鼠和山羊胚胎成纤维细胞作饲养层,并采用含不同生长因子的培养液进行培养,比较了饲养层和生长因子对分离培养山羊类ES细胞的影响。结果表明:采用MEF饲养层其ICM增殖率优于GEF饲养层;与对照组相比,培养液中添加LIF及SCF或胰岛素对山羊ICM的贴壁增殖及传代都有积极影响;以MEF为饲养层,培养液中同时添加LIF和SCF时,培养山羊类ES细胞的效果最佳,传至3代。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和饲养层细胞的制备

通过实验确定分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄,探讨小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的效果及其寿命。结果表明,从１０ 、１１ ｄ 小鼠胚胎所获的胚胎成纤维细胞中混有大量神经母细胞和红细胞;用１４ 、１５ ｄ 的胚胎则基本不能获得胚胎成纤维细胞;消化３ ～４ 个１２ ～１３ ｄ 胚胎所获细胞悬液可接种８～９ 个２５ ｃｍ２ 的培养瓶。从一只孕鼠的所有胚胎所获的成纤维细胞可接种约２０ 个２５ ｃｍ２ 的培养瓶。所获细胞悬液的活细胞百分率可达９０％ ,接种成活率达８５ ％ 。胚胎成纤维细胞贴壁时间为５～６ ｈ ,１２ ｈ 后进入增殖期,４８ ｈ 形成细胞单层。ＥＳ细胞克隆在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上形态典型、增殖迅速、不分化。饲养层寿命可维持２ ～３ 周。     

ICR小鼠胚胎干细胞的分离与培养

为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响,试验以12.5～13.5 dICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5 d ICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响.结果表明:采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69.0%)均...     

昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化

为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞,本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×104、1×105、1×106·mL-1密度接种,以H-DMEM+15%KSR+LIF为培养液,观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)生长的影响,并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(SCF)、SCF+胰岛素对昆明小鼠ES细胞分离克隆的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105·mL-1的饲养层上,F1代和F2代ES细胞克隆形成率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(P<0.05),培养液中添加SCF显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(P<0.05),同时添加SCF和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞克隆形成率。所分离的ES细胞显示AKP染色强阳性,Oct-4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性,具有ES细胞的特点。由此认为,发育至囊胚的胚胎在MEF密度为1×105·mL-1上,培养液中同时添加SCF和胰岛素更适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。     

提高猪囊胚后期贴壁能力的优化培养体系

为了提高猪孤雌囊胚贴壁率,试验从饲养层及培养液两方面研究猪孤雌囊胚贴壁能力;用小鼠、猪和牛的胎儿成纤维细胞制作饲养层,分别添加DMEM、NCSU-23、DMEM/NCSU-23培养液,探讨猪孤雌囊胚在3种饲养层上的发育效果。结果表明,BEF饲养层能更好地促进猪孤雌囊胚贴壁生长,其囊胚贴壁率为33.67%,与MEF饲养层组的囊胚贴壁率(19.08%)之间差异显著(P0.05),与PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05),MEF饲养层组和PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05);在BEF牛胎儿成纤维细胞饲养层组,用猪胚胎培养液NCSU-23培养猪孤雌囊胚后,囊胚贴壁率(22.53%)显著高于DMEM培养液组(10.41%)和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组(12.05%)(P0.05),DMEM培养液组和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组之间差异不显著(P0.05)。牛胎儿成纤维细胞饲养层和猪胚胎培养液NCSU-23能更好地促进猪孤雌囊胚后期贴壁。     

昆明系小鼠饲养层细胞制备条件的优化

通过分离不同胚龄的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),对MEF进行连续传代培养,并对MEF不同的消化时间进行探讨,研究影响小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养的因素.结果表明,分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄是12.5 d～14.5 d;37℃条件下,用2.5 g/L胰蛋白酶作用PMEF,作用时间不应超过15min;离散贴壁的成纤维细胞,作用时间以2 min～3 min为宜;MEF在第2代～第5代增殖旺盛,7代以后细胞出现急剧下降.所以选择第3代MEF是制做饲养层的最佳时机.MEF分离方法简单,来源方便,增殖迅速,是用于胚胎干细胞分离培养的有效培养体系.     

DNA甲基化对早期胚胎发育的影响

综合分析了DNA甲基化的表观遗传特征,结合DNA甲基化在不同物种、不同发育阶段胚胎中的调控模式,以期从早期胚胎死亡角度揭示DNA甲基化作用对胚胎早期发育基因的表达调控作用,进而阐明胚胎发育过程中的表观遗传调控机制。     

囊胚注射转基因ES细胞制作嵌合体的研究

在小鼠胚胎成纤维细胞制作的饲养层上培养并成功的维持了携带LacZ基因的胚胎干细胞系（S8），在此基础上，以S8为供体细胞，以远交系昆明白小鼠3．5d胚胎为受体，通过显微注射法将供体细胞转移到受体的囊胚腔内，经过恢复培养，移植到代孕鼠昆明白雌鼠的子宫中；后代在嵌合体出生一周后进行判定。本试验用8～13代的S8细胞共注射胚胎597枚，经1～3h恢复培养，有585枚胚胎重新具有膨大的囊胚腔，细胞轮廓分明，滋养层细胞间连接也清晰可见，胚胎成活率为97％；胚胎移植后，代孕母鼠共移植胚胎228枚，经17～19d的妊娠期后，产仔37只（2只死胎），产仔率为16％；有35只仔鼠（雄鼠18只，雌鼠17只）存活到可以判断毛色，共获得8只S8细胞毛色嵌合体小鼠，嵌合体的产生率为21．6％。结果表明用S8细胞经囊胚注射后能够获得嵌合体，并且嵌合体明显发生了性偏离现象。本试验为国内利用囊胚注射携带LacZ基因的胚胎干细胞获得嵌合体小鼠的首例报道。     

降钙素基因相关肽在鸭腔上囊胚胎及胚后发育过程中的表达

应用免疫组织化学技术研究降钙素基因相关肽在鸭腔上囊胚胎及胚后发育过程中的表达特征.结果显示,降钙素基因相关肽强阳性细胞出现于20 d胚龄至胚后14周龄的滤泡间上皮,20 d胚龄至胚后17周龄的小结相关上皮,新生雏至胚后14周龄的滤泡皮质,24 d胚龄至胚后14周龄的滤泡髓质,20 d胚龄至胚后14周龄的肌层和小动脉平滑肌.结果说明,降钙素基因相关肽表达于鸭腔上囊的不同部位及不同发育阶段;在腔上囊退化期,降钙素基因相关肽的表达表现出明显的变化特征,这可能是导致腔上囊退化的原因之一;滤泡间上皮与小结相关上皮在神经肽表达方面存在差异.     

基于高通量测序的水貂胚胎滞育期和激活期卵巢转录组分析

试验旨在获取胚胎滞育期与激活期水貂卵巢组织的转录组信息，挖掘滞育的胚胎激活前后水貂卵巢差异表达基因（DEGs）及其功能信息，为探讨卵巢信号调控水貂胚胎滞育的分子机制提供参考。随机采集8只健康雌性水貂（胚胎滞育期和激活期各4只）的卵巢组织为样本，利用Illumina HiSeq平台RNA-Seq技术对其进行转录组测序，筛选在水貂胚胎滞育期和激活期卵巢中的DEGs并进行生物信息学分析。结果显示，测序获得661 195 568个raw reads，经过滤后获得650 834 900个clean reads，组装后得到389 895个unigenes，通过与Nr、GO、KOG和KEGG数据库比对，对unigenes进行注释，其中Nr数据库注释了156 419个unigenes；GO数据库注释了122 657个unigenes；KOG数据库注释了58 320个unigenes；KEGG数据库注释了72 653个unigenes。滞育期和激活期卵巢中有1 797个DEGs，与胚胎滞育期水貂卵巢相比，激活期卵巢有1 298个DEGs显著上调，499个DEGs显著下调。GO功能分析发现，DEGs显著富集的生物学过程主要有跨膜信号受体活性、信号受体活性、G蛋白偶联受体活性、酶联受体蛋白信号通路、细胞表面受体信号通路、细胞周期阻滞、芳香酯酶活性。KEGG通路分析发现，水貂滞育期和激活期卵巢中的DEGs显著富集于神经活动配体-受体相互作用信号通路。本研究利用高通量测序技术获得水貂胚胎滞育期与胚胎激活期卵巢的转录组信息，为深入探究水貂卵巢调节胚胎滞育的分子机制奠定了基础。     

胚胎干细胞分化研究进展

胚胎干细胞分化的研究已成为生物学领域中的研究热点,也是生物工程、组织工程产业化的主要方向,文章对胚胎干细胞的生物学性质、分化机制、诱导途径及研究进展做一综述.     

Follicular Development and Ovulation in Sows: Effect of hCG and GnRH Treatment

Follicular growth, chronology of ovulation and embryo morphology were compared in sows ovulating spontaneously and sows, in which the ovulation was attempted induced by hCG or GnRH.Indwelling catheters were placed on day 1 (weaning = day 0) in the ear veins of 18 sows, which were then randomly divided into 3 groups: a control group (N = 6), a group (N = 6) given 750 iu hCG (Physex®) im 76h after weaning (hCG group) and a group (N = 6) given 500 µg GnRH (Fertagyl®) im 76h (N = 3) or 100h after weaning (N = 3) (GnRH group). Follicular diameter and time of ovulation were monitored by ultrasonography every 4h from day 3 until ovulation or development of cysts by means of a sector scanner fitted with a 5.0/7.5 MHz multiangle probe. Heat detection was performed every 8h from day 3 until ovulation. On day 13, the sows were slaughtered, the number of corpora luteae (CL) was counted, and embryos were flushed from the uteri. The control group showed clear heat symptoms, and on day 3, the follicles were typically 3–7 mm and grew up to 7–10 mm over 2 days, where they remained for approximately 24h until ovulation took place 41h ± 9h after first sign of standing heat. The hCG group exhibited no signs of heat, and the follicles only reached 5–8 mm in diameter at time of ovulation, which occurred 40h ± lh after hCG-injection. The GnRH group exhibited inconsistent signs of heat, and the follicles reached a maximum size of 7–12 mm in diameter where they remained for more than 24h. Only 2 sows in this group ovulated within 84–92h after the GnRH injection, and development of bursa cysts and cystic follicles was a common finding. The average number of CL was 18.2 ±5.7 per sow (N = 16, range: 3–27) with no significant difference between the groups. Total embryo recovery was 79 ± 13 % with no significant difference between groups. The embryo diversity calculated as standard deviation of the maximum diameter was higher in the hCG group as compared with the control group.It is concluded that (1) transrectal ultrasonography can be used in sows for accurate assessment of follicular growth and ovulation; (2) the use of hCG results in lack of heat symptoms and reduced follicle size at the time of ovulation when injected 76h after weaning; (3) administration of a single injection of GnRH, if given before the first signs of heat, results in inconsistent heat symptoms and no or late ovulations.     

胚胎干细胞的体外诱导分化

胚胎干细胞是从早期囊胚内细胞团或桑葚胚中分离的一种多潜能细胞，具有体外无限增殖和自我更新能力，而且还能被定向诱导分化形成机体几乎所有的细胞类型，如肝细胞、造血细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞、肌肉细胞、胰岛细胞、内皮细胞、黑色素细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等。     

猪2-细胞胚胎细胞的电融合

为了探索猪胚胎细胞核移植技术中细胞融合参数，进行了猪２－细胞胚胎细胞的电融合。电融合时，直流电场强度为２ｋＶ／ｃｍ，脉冲时程选４０μｓ时，可获得７０．４％的融合率和６８．４％的发育率。非电解质融合液（甘露醇）对于融合率和融合胚的发育均优于电解质融合液（ＤＰＢＳ）。在直流电脉冲前的交流脉冲是必要的，可以显著提高融合率（Ｐ＜０．０５）。