C3d对减毒沙门氏菌介导的NDV DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答的增强作用

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F扩增出新城疫病毒F48E8株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入含有3 拷贝C3d 编码基因的pTR-C3d3质粒中,获得重组质粒pTR-F-C3d3。将F-C3d3基因片段从pTR-F-C3d3中切出,克隆入真核表达质粒pVAX1中,获得重组真核表达质粒pVAX1-F-C3d3。将pVAX1-F-C3d3转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-F-C3d3)。重组菌分别以1×109 CFU的剂量两次口服免疫1日龄SPF鸡,结果显示,SL7207(pVAX1-F-C3d3)激发产生的血清抗体效价与SL7207 (pVAX1-F)免疫组之间存在显著性差异(P < 0.05)。SL7207(pVAX1-F-C3d3)免疫组的小肠黏膜抗体效价高于SL7207(pVAX1-F)免疫组,但两者间差异不显著(P > 0.05)。提示C3d可增强减毒沙门氏菌介导的NDV DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答水平,这为提高基于减毒沙门氏菌的NDV基因工程疫苗的免疫效果提供了新的途径。     

鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F.通过脂质体介导DNA瞬时转染法,将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞,Western blot验证表明,pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白,表达蛋白分别为76.0和59.6 kD,表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性.将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus),6d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体,免疫20 d后,用F48E9进行攻毒.结果显示,免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P＜0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F,高于免疫pcDNA-F的鸡群,但比免疫Lasota组的抗体水平要低.攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高,这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用,为病毒病疫苗的研制提供了思路.     

新城疫病毒（NDV）-F基因（NDV-F）稳定表达P815细胞株的建立

在成功构建新城疫病毒(NDV)-F基因真核表达载体pCDNA3-NDV-F的基础上,应用脂质体LipofectamineTM2000介导法,将其转染小鼠肥大细胞瘤细胞株(P815),经过加入G418(600 靏/mL),筛选得到稳定的细胞克隆株,并进一步扩大培养.应用Trizol法提取细胞RNA,经RT-PCR鉴定,转染细胞提取物在1 600bp处出现目的条带.收集转染细胞,经Westernblot和免疫荧光法检测到表达的目的蛋白.将获得的细胞株在液氮中冻存6个月后检测,该细胞株仍能很好表达NDV-F基因,表明其具有高度稳定性,证明采用脂质体法已成功地建立了能够稳定表达NDV-F基因的细胞株.     

4个沉默鸡恒定链基因(Ii)慢病毒载体的构建及其效果比较

恒定链(invariant chain,Ii)是脊椎动物重要的免疫分子,在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子递呈抗原中起重要作用。为研究鸡(Gus gallus)Ii与MHCⅡ类分子的关系,本研究构建了4个沉默Ii基因的慢病毒表达载体,并比较了其干扰效果。首先,用自行设计合成的4条鸡Ii基因干扰序列,分别经一步退火法获得双链短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),并将其用双酶切法插入慢病毒载体pLL3.7。4个构建的慢病毒重组载体经酶切和测序鉴定,分别命名为pLLIi-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527和pLL-Ii-shRNA539。然后把这些重组载体分别转染293T细胞(转染腺病毒E1A基因(lethal infection gene)的人肾上皮细胞系),进行病毒包装,再用包装的慢病毒感染鸡源巨噬细胞HD-11。结果表明,重组载体感染的293T细胞表达绿色荧光蛋白,用包装的慢病毒接种293T细胞,其滴度达2.2×107~5.1×107TU/mL;接种HD-11细胞的感染率均达到95%以上。最后用荧光定量PCR方法检测其沉默鸡源巨噬细胞HD-11的鸡Ii mRNA的效率,与对照组相比,4个重组慢病毒干扰效率分别为37%、52%、88%和78%;其中,pLL-Ii-shRNA527的干扰效率最高。综上所述,本研究从4个构建的重组载体中筛选出1个高效沉默鸡巨噬细胞Ii基因重组载体,并提示shRNA序列是决定沉默特定基因的关键。实验结果为研究鸡Ii在递呈抗原中与其他免疫分子的关系提供了基础资料。     

运送鹅源新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌及其免疫原性

根据GenBank中发表的新城疫病毒融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RT-PCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,约1700bp,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,得到候选DNA疫苗pVAX1-F0将pVAX1-F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)X4550,获得运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550(pVAX1-F).以2×108CFU/只的剂量两次免疫CD1小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对NDVF蛋白的血清抗体应答,X4550(pVAX1-F)免疫组抗体水平显著高于X4550(pVAX1)组(P＜0.05),表明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并能够刺激机体产生免疫应答.     

新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因在鸡痘病毒中的表达及其部分序列分析

通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增了新城疫病毒(NDV)F48E8株核衣壳蛋白(NP)基因,并克隆到pUC18中,得阳性克隆pUCNP.应用分子克隆技术,将NP基因导入鸡痘病毒(FPV)转移载体pFG1175-1中P7.5启动子的下游,得到含NDV NP基因的质粒pFGNP1175-1.利用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV疫苗株282E4感染3～4 h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化多次,得到稳定的重组FPV.用狄高辛标记的探针进行斑点杂交实验,结果表明pFGNP1175-1已与FPV 发生同源重组;用抗NDV的SPF鸡的阳性血清进行间接免疫荧光实验,证实重组FPV在感染细胞中表达了F48E8株NP蛋白.该基因两端部分序列与已发表的D26株NP基因对应区域的核苷酸同源性为89.1%,推断的氨基酸同源性则为93.1%.     

利用shRNA真核表达载体干涉雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)的表达

本研究通过把构建的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚,检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)mRNA表达效率,进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性.实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体,一条非特异性表达载体.每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射,并设立空白对照组.鸡胚发育12d时,检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况,并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析.研究结果表明,导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP);荧光定量结果显示,导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295后,对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组,干涉效率分别为:73％、52％和85％;特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异.本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台.     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

法氏囊素在大肠杆菌中的表达及其免疫增强活性

选用大肠杆菌(Escherichiacoli)编码赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)和甘氨酸(Gly)的常用密码子按顺序排列成BS基因:5'-AAACACGGT-3'。连续合成10个BS(BS10)串连基因单链及其反向互补链,通过退火使其复性成双链。BS10基因经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,克隆进表达载体pGEX-6P-1中。获得的重组质粒pGEX-Bur转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,串连的BS10基因获得了高效表达。表达产物经GST亲和层析和胰酶消化处理后,按适当的浓度和新城疫病毒(NDV)混合,免疫90只30日龄的小白鼠。分别在免疫后第7,14和21天,用血凝抑制试验(HI)测定小鼠血清中NDV的抗体水平,结果加入囊素的实验组比不加囊素的对照组HI平均高出22.5个滴度。同样的实验样品免疫100只8日龄SPF(speclficpathogenfree)鸡,15d后实验组的抗体水平比对照组平均高出20.7个滴度。研究结果证实了用大肠杆菌表达的法氏囊素对小鼠和鸡具有免疫增强的作用。     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.