鸡胚性分化早期性别差异表达miRNAs的表达谱分析

为研究microRNA(miRNA)在鸡胚早期性分化过程中的表达,探讨miRNA在性腺早期发育中的作用,本研究从前期以3.5～6.5 d的雌、雄鸡(Gallus gallus)胚胎性腺为材料的miRNA芯片表达谱中筛选出6个性别差异表达的miRNAs(其中miR-551b和miR-612为鸡新miRNAs),采用RNA加尾以及引物延伸的半定量RT-PCR方法研究这些差异表达miRNAs在3.5～6.5 d雌、雄鸡胚性腺中的表达,并验证其中新miRNAs的茎环前体结构.RNA folding软件折叠结果表明,预测的鸡miR-612和miR-551b均具有茎环状的前体结构.半定量结果表明,这6个miRNAs均存在不同程度的性别差异表达.除4.5 d外,gga-miR-612和gga-miR-1456在其它检测时期的表达为雌性高于雄性;在4.5～6.5 d鸡胚性腺中,gga-miR-551b在雄性中表达显著高于雌性(P<0.05);gga-miR-126在3.5和6.5 d雌性性腺中的表达低于雄性,而4.5和5.5 d则相反;gga-miR-1599在所检测时期中均为雄性中高表达且在4.5 d达极显著水平(P<0.01),gga-miR-10b的表达与之相反.根据表达谱结果推测gga-miR-551b以及gga-miR-1599可能涉及早期鸡胚性腺发育过程.     

大麻素Ⅰ型受体基因(CNR1)特异性siRNA表达载体的构建及稳定干扰阳性L6细胞克隆的筛选

大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用.为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系.设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3.并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果.并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选.结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45％(P＜0.01)、8.57％(P＜0.01)和8.71％(P＜0.01);干扰效率为39％(P＜0.05)、64％(P＜0.01)及68％(P＜0.01).稳定筛选的最佳G418浓度为800 μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43％(P＜0.05)、78％(P＜0.01)及91％(P＜0.01).干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系.本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料.     

以鸡恒定链(Ii)为载体的新城疫病毒-F蛋白表位基因疫苗的免疫原性

本文研究了以鸡恒定链基因(invariant chain,Ii)为载体的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因片段的基因疫苗及其小鼠的免疫应答.首先,用重叠延伸法经3轮PCR获得以NDV-F343表位基因(327-359 AA)取代鸡恒定链中Ⅱ类分子相关肽段(class-Ⅱassociated invariant chain peptide,CLIP)片段序列,构建了基于恒定链的NDV内源性靶向基因疫苗(C1-△CLIP-Ii-F343).其次,在观察C1-△CLIP-Ii-F343和无恒定链载体的C1-F343转染真核细胞中,发现它们均能在COS-7细胞中高效表达.最后,将25只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠(Mus musculus)随机分为5组,用C1-△CLIP-Ii-F343和非靶向性疫苗(C1-F343)进行免疫,以C1-△CLIP-Ii、pEGFP-C1和生理盐水作为对照.经3次免疫后,取小鼠尾部血对小鼠的体液免疫进行检测.结果表明,在C1-△CLIP-Ii-F343和C1-F343免疫组小鼠血清中均可检测到针对NDV的特异性抗体,其滴度分别达到1/6400和1/1600.进一步Western blot研究结果表明,抗体与接种NDV的鸡胚尿囊液和原核表达的PET-NDV-F306蛋白均产生特异性结合.研究结果提示,鸡恒定链作为载体的NDV基因疫苗能够刺激小鼠产生特异性的体液免疫应答,为新城疫疫苗开发提供了一个新的思路.     

鸡输卵管组织特异性分泌表达载体的构建和表达

摘要：为了实现外源基因在鸡(Gallus gallus )输卵管上皮细胞内的特异性分泌表达，采用RT-PCR的方法扩增了鸡溶菌酶基因的450 bp的cDNA片段，该片段保留了5ˊ端信号肽编码序列。将该片段插入到含有1.2 kb卵清蛋白5ˊ调控序列的特异性表达载体pOVA-GFP中，与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，使融合蛋白具有分泌功能。新构建的分泌表达载体pOVALG转染鸡胚成纤维细胞和大鼠乳腺上皮细胞系SHZ-88后，成功地检测到了绿色荧光蛋白的表达。     

鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F.通过脂质体介导DNA瞬时转染法,将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞,Western blot验证表明,pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白,表达蛋白分别为76.0和59.6 kD,表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性.将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus),6d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体,免疫20 d后,用F48E9进行攻毒.结果显示,免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P＜0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F,高于免疫pcDNA-F的鸡群,但比免疫Lasota组的抗体水平要低.攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高,这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用,为病毒病疫苗的研制提供了思路.     

聚合酶Ⅱ转录的sRNA与RNA沉默抑制子对TMV病毒载体表达系统作用的比较

聚合酶Ⅱ介导合成的外源短链RNA(short RNA,sRNA)可以竞争性地抑制内源mRNA的核质转运,推测共表达sRNA可以间接地提高病毒载体表达系统的表达效率.为了验证这一假说和评价其应用潜能,本研究采用基因体外合成技术和亚克隆技术,分别构建了聚合酶Ⅱ转录的拟南芥U6-1 RNA和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)编码的RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressors,RSSs)2b的植物表达载体.以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)表达载体共接种寄主植物本氏烟(icotiana benthamiana),通过对报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的荧光观察,并以Western blot和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbnent assay, ELISA)测定GFP在烟草中的表达情况,分析sRNA对植物病毒载体表达系统的作用和可能的作用机制.同时通过与RSSs比较,评价sRNA在植物生物反应器中的应用潜能.实验结果表明,聚合酶Ⅱ转录的sRNA能有效地提高TMV病毒载体介导的外源基因在植物中的表达(GFP表达量比对照组高约2.5倍),而且能够显著地降低TMV诱导的病程相关蛋白2(Pathogenesis-related protein 2,PR2)在细胞内的积累水平(PR2表达量比对照组下降约8倍).推测Ⅱ型启动子转录的sRNA通过竞争性地抑制宿主抵御病毒入侵相关蛋白合成的mRNA核质运转促进病毒RNA介导的外源基因在植物中的表达.此外,Ⅱ型启动子转录的sRNA的作用效果与CMV病毒编码的RNA沉默抑制子2b相当.研究结果为提高病毒载体介导的外源基因在植物中的表达提供了一条可供借鉴的思路.     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞研究

提取第28 期鸡胚性腺中的原始生殖细胞(PGCs)，将其与性腺基质细胞共培养，并对PGCs 进行PAS (过碘酸希夫试剂) 和AKP(碱性磷酸酶) 染色鉴定。构建pLenti-CMV-eGFP 慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293FT 细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs，转染率高达24.19 %。实验还比较了慢病毒不同剂量对转染效率的影响，随着慢病毒剂量的增加，转染效率显著提高。     

钙调磷酸酶催化亚基A基因(PPP3CA)在不同品种鸭发育早期肌肉中的表达及其与肌纤维特性的相关性

钙调磷酸酶催化亚基A(protein phosphatase 3 catalytic A,PPP3CA)是PPP3C在骨骼肌中的主要亚型,在肌纤维分化中起重要作用.为研究PPP3CA基因在不同品种鸭(Anas platyrhynchos domestica)发育早期肌肉中的表达规律及其与肌纤维特性的相关性,本研究选用生长速度差异较大的金定鸭和高邮鸭,采用实时荧光定量PCR检测鸭13、17、21、25和27胚龄及7日龄胸肌和腿肌中PPP3CA mRNA的表达水平.结果表明,两鸭种同一肌肉组织中PPP3CA mRNA的表达表现出显著的时间特异性,而品种和性别效应并不显著.两鸭品种胸肌和腿肌中PPP3CA mRNA的表达模式虽不同,但均是在13胚龄(13embryonic day,E13 d)时最高,且在出雏后7日龄时极显著高于27胚龄(出雏前)(P＜0.01).胸肌中PPP3CA mRNA在21胚龄时显著低于其他各胚龄或日龄(P＜0.01);腿肌中PPP3CA mRNA在21胚龄时表达量较高,27胚龄时降到最低,且极显著低于其他各胚龄或日龄(P＜0.01).相关性分析结果显示,两鸭品种腿肌PPP3CA mRNA表达量与本研究前期检测的肌纤维类型、直径、面积和密度等肌纤维特性呈现不同程度的线性相关;两鸭品种胸肌和腿肌PPP3CA mRNA表达量与均与本研究前期检测的类胰岛素生长因子(insulin-like grow factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)mRNA表达量呈显著的正相关(P＜0.05或P＜0.01).初步推测鸭发育早期骨骼肌中PPP3与肌纤维类型和肌纤维生长发育密切相关,与IGF-Ⅰ可能共同参与了对骨骼肌生长发育的调节.本研究结果将有助于了解PPP3在鸭肌肉早期发育中的作用,并为改良鸭肉品质提供理论依据.     

睡美人转座子真核表达载体的构建及在猪胎儿成纤维细胞系中的表达验证

睡美人(sleeping beauty,SB)是Tc1/mariner转座子超家族的一员,为探索睡美人转座子与不同的转座酶搭配使用及与同种转座酶不同比例搭配使用时的转座效率,本实验构建了SB真核表达重组载体PT2-SV40-EGFP,通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测进行了猪胎儿成纤维细胞系(PEFs)转染条件优化研究.研究结果表明,不同转座酶与转座子按10∶1混合后细胞转染效率相似,但报告基因表达水平有较大差异,其中SB 100X转座酶与转座子混合后细胞的表达水平最高;转座子PT2-SV40-EGFP质粒和SB 100X转座酶质粒按不同比例混合转染细胞研究表明,细胞转染效率相似,但表达水平存在显著差异,其中1∶1组最高,约是5∶1组和10∶1组的50倍.本实验优化了睡美人转座子的转座条件为制备转基因动物深入研究提供参考.     

联合基因Survivin、CDK1的shRNAs靶向干扰对鼻咽癌CNE-2细胞增值的影响

为了构建具有干扰效应的靶向Survivin和CDK1基因及两者串联的短发夹样RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体,并研究其靶向干扰对鼻咽癌细胞CNE-2生物学行为的改变。本研究通过构建pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体,用脂质体Lipofectamine 2000法将其转染入CNE-2细胞株中,应用RT-PCR方法初步筛选具有干扰效应的重组载体,逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测Survivin、CDK1 mRNA的基因表达水平,Western blot检测Survivin和CDK1蛋白表达以及噻唑蓝溴化四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）检测癌细胞增殖活性的变化。结果表明：成功构建具有干扰效应的shRNAs表达载体;联合或单基因Survivin、CDK1的shRNAs表达载体干扰CNE-2细胞后,其对应的mRNA和目的蛋白表达均降低,CNE-2癌细胞增殖活性降低,联合基因shRNAs表达载体具有一定程度的干扰增强作用。     

猕猴自然流产胎儿胸腺白细胞介素2和10的分布与表达

胸腺是哺乳动物的中枢免疫器官。为了解猕猴胎儿中枢免疫器官在自然流产时的免疫应答情况,采用猕猴(Macaca mulatta)自然流产胎儿为材料,通过HE染色和免疫组化染色对不同胎龄猕猴胎儿胸腺白细胞介素2和10(IL-2;IL-10)阳性细胞的分布及表达进行观测,研究其在自然流产过程中的表达情况。结果表明:猕猴胎儿胸腺各胎龄组小叶间分界清晰,小叶数量皮质髓质中淋巴细胞数量也逐月增加;2月胚龄髓质形成,开始出现弥散型胸腺小体,3月胚龄髓质中可见典型胸腺小体,胸腺组织结构趋于完善。胸腺IL-2和IL-10的表达在1月龄无阳性,此后阳性细胞的光密度值和阳性细胞面积率随着月龄的增加而增长;阳性细胞分布于皮质边缘、皮质与髓质交界处、髓质中心区,以及没有退化的胸腺小体和血管周围;IL-2在胸腺中的表达强烈且数量多,IL-10表达较少。研究结果提示两种细胞因子主要在胸腺细胞发育增长活跃区域表达,并以IL-2表达为主,IL-2和IL-10的分泌水平可作为预测孕妇早产的一个新的敏感指标。     

鸡核受体辅激活蛋白基因(NCOA1)SNPs分析及mRNA的表达

核受体辅激活蛋白基因(NCOA1)是类固醇激素受体超家族中的一员,在生殖细胞的生长和分化过程中起着重要的调节作用。本研究利用PCR-SSCP技术对NCOA1基因外显子的多态性进行了分析,在第3和12外显子上分别发现了SNPs位点,并采用实时荧光定量PCR对多态性位点处mRNA表达水平进行了研究,发现NCOA1基因随着生长发育其表达量呈波动性增加,14周龄前表达量很少,随着性成熟NCOA1基因表达量快速增加,28周龄时其表达量达到峰值,之后表达量下降。产蛋性能较好的母系鸡NCOA1基因的相对表达量比产蛋性能较差的父系鸡较早地开始增加,并且在14周龄后表达量显著高于父系鸡(P<0.05)。同位点对产蛋性能有显著影响的优势基因型AA和CC个体的表达量在16周后也显著高于同位点的其他基因型个体(P<0.05)。研究提示NCOA1基因mRNA表达水平影响鸡的性成熟过程和产蛋性能。     

黑番鸭血管活性肠肽受体-1基因(VIPR-1)的cDNA克隆及其组织表达特性分析

最近的研究表明,血管活性肠肽(VIP)与家禽的就巢习性密切相关。本研究采用反转录PCR方法从黒番鸭(Cairina moschata)母鸭下丘脑组织中克隆了血管活性肠肽受体(VIPR-1)基因的cDNA序列,长度为1125bp,编码355个氨基酸(GenBank登录号:JN625215)。序列比对结果表明,该序列与家禽(鸡、火鸡、鹌鹑)和哺乳动物(人、小鼠、猪、牛)的基因序列分别有93%~94%和69%~71%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性分别为96%和70%~72%。荧光定量PCR结果发现,黒番鸭VIPR-1基因的表达量在产蛋期、就巢期和休产期差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),就巢期表达量最高,休产期次之,产蛋期表达量最低,表明VIPR-1基因与繁殖阶段变化密切相关;对不同组织VIPR-1的表达量分析发现,VIPR-1在垂体、下丘脑和卵巢中均有表达,其中垂体最多,其次是下丘脑,卵巢中的表达量最低,差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,VIPR-1基因具有高度保守性,参与下丘脑-垂体-卵巢轴(特别是垂体)对黑番鸭就巢行为的调控。     

利用RNA干扰技术抑制水稻淀粉极限糊精酶基因表达

构建了含极限糊精酶基因片段反向重复结构的RNAi载体,抑制水稻籽粒中极限糊精酶基因表达获得了极限糊精酶基因功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实,成功地构建了胚乳特异表达启动子启动的水稻极限糊精酶基因反向重复结构RNAi载体;通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导水稻(Oryza sativa sp.japonica)转化,经PCR及Southern杂交检测,获得28个水稻转基因再生株系;以极限糊精酶抗体对转基因株系胚乳发育期籽粒蛋白质进行Western杂交,并经SDS-PAGE极限糊精酶活性检测,结果显示,该反向重复结构在胚乳发育期表达,减少了极限糊精酶的积累,获得了不同沉默效果的转基因株系。转化株系012的极限糊精酶活性只有野生型的10%,表明该载体可有效地抑制水稻胚乳中极限糊精酶的活性。     

猪microRNA-378-1过表达载体构建及细胞水平验证

microRNA对细胞的增殖和分化有着重要的调节作用,从大白猪(Susscrofa)基因组DNA上扩增microRNA-378-1前体序列,经XhoⅠ酶切后回收相应片段,连接到pEGP-miR载体中,构建重组载体pEGP-miR-378-1,转染猪胎儿成纤维细胞系(PEF),通过荧光观察转染效率及报告基因的表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内microRNA-378-1的表达活性。结果表明,成功地构建了重组载体pEGP-miR-378-1;荧光观察转染后的细胞,显示有较高的转染效率,报告基因有较高的表达效率;QRT-PCR结果显示,实验组和对照组microRNA-378-1表达显著提高,实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01);为制备转基因动物研究microRNA-378-1功能提供技术平台。     

断奶前后仔猪十二指肠、空肠和回肠SGLT1 mRNA表达的变化及半胱胺的影响

研究断奶前后仔猪十二指肠、空肠和回肠SGLT1mRNA表达丰度的变化,并同时观察半胱胺对其表达的影响,从分子水平探讨半胱胺对断奶仔猪葡萄糖吸收的影响与可能的机制。新生仔猪随机分为对照组和实验组,12日龄(D12)起对照组饲喂基础乳猪料,实验组在基础乳猪料中添加120mg/kg半胱胺,两组仔猪均于35日龄断奶,每组分别于断奶前1周、断奶当天、断奶后3d、1周以及断奶后10d随机选取仔猪各6头,宰杀后采集十二指肠、空肠和回肠粘膜,采用RT-PCR方法测定钠-葡萄糖共转运载体1(sodium-glucosecotransporter1,SGLT1)mRNA表达的相对丰度。结果表明,回肠SGLT1mRNA的表达量最高,空肠其次,十二指肠最低;SGLT1mRNA在不同肠段的表达呈现截然不同的发育模式,十二指肠SGLT1mRNA表达量在45d显著上升(P<0.05),而空肠则在42和45d时显著下降(P<0.01),回肠SGLT1mRNA表达在整个实验期间无显著变化;此外,日粮添加半胱胺显著提高38d十二指肠以及42和45d空肠SGLT1mRNA表达,而对回肠SGLT1mRNA表达无显著影响。小肠SGLT1mRNA表达以及日粮添加半胱胺促进SGLT1mRNA表达的作用均呈现时空特异性规律。     

小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。     

草鱼羧肽酶A1基因(CPA1)部分片段的单核苷酸多态性(SNP)多态性及其与生长性状的关联分析

羧肽酶A (EC 3.4.16)是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸残基的消化酶.在草鱼生长相关的功能基因上研究单核苷酸多态性(SNP)与生长的相关性可为草鱼的分子辅助育种提供依据.本研究根据草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST-SNP库的羧肽酶A1基因(CPA1)重叠群的2个Contig扩增该基因的序列片段,采用直接测序法,经过序列比对,共筛到2个颠换SNP位点:C+412A和A36C,分别位于CPA 1基因外显子5的34bp和内含子3的36 bp处,前者为错义突变.然后用一个群体的296尾草鱼对这2个位点用SnaPshot的方法进行检测和分型,统计基因型频率:A36C位点的AA基因型占26.7％,AC基因型占52.0％,CC基因型占21.3％.C+412A位点的AA基因型占15.5％,AC基因型占40.5％,CC基因型占43.9％.利用一般线性模型分析2个SNP位点与草鱼体质量、体长等重要生长性状的关系.关联分析结果显示,C+36A位点不同基因型在体质量、眼间距均值上存在显著差异(P＜0.05).并且AA基因型和CC基因型在体质量、体长、体宽和眼间距上存在显著差异(P＜0.05).AA基因型各项指标均值显著高于CC基因型.C+412A位点在体质量等生长性状上差异不显著(P＞0.05),该位点和生长不相关,但是CC基因型和AC基因型在体重和肛前距上差异显著(P＜0.05),该位点CC基因型的6个生长性状均值都高于AA基因型.由两个位点组成的5种双倍型在体质量上存在显著差异(P＜0.05).双倍型D3和D5在体质量上存在差异显著(P＜0.05).双倍型D3和D8在体质量、体宽、体长、体长/头长等生长性状上都存在显著差异(P＜0.05).D3的各项指标均值最高,D8的各项指标均值最低.本研究结果显示,可以考虑将草鱼CPA1基因作为候选基因,用于草鱼的分子辅助育种.     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。