浙江省南美白对虾苗种五种流行病病原检测与分析

为了解浙江省南美白对虾主产区苗种主要病原的携带情况,对杭州、宁波、嘉兴和绍兴4个地区的苗种场开展了病原检测。129批次样品的检测结果显示:有4种病原检出阳性,阳性检出率分别为南美白对虾白斑综合症病毒(WSSV)1.55%、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)20.93%、虾肝肠胞虫(EHP)31.78%、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)37.21%,而桃拉综合症病毒(TSV)未有阳性检出。结果表明,SHIV、EHP、IHHNV是浙江省对虾苗种携带的主要病原,需要重点加以防范。从整体分布看,宁波市南美白对虾苗中携带的病原种类最多,且携带率较高,提示宁波市需要加强防控。从苗种来源看,来自福建省虾苗的IHHNV携带率最高,为38.10%;来自海南省和广东省虾苗中存在WSSV感染,检出率分别为2.17%和2.27%;来自广东省虾苗的EHP和SHIV携带率最高,分别为43.48%和41.30%。由于浙江省南美白对虾苗种主要依靠外地输入,而这些输出地区的苗种病原感染率较高,因此浙江省需要加强从这些地区引入苗种的检疫工作。     

2020年浙江省宁波市南美白对虾虾苗主要病原携带情况调查

为了解浙江省宁波市对虾主养区苗种虾肝肠胞虫(EHP)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)以及导致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VP)4种病原的携带情况及特点,2020年2—8月采用PCR检测方法,对象山、宁海、奉化、余姚、慈溪、鄞州等地虾苗进行4种病原检测。结果显示:共检测45个养殖场点的南美白对虾虾苗样品268批次,在41批次虾苗样品中检出至少1种病原,整体阳性率为15.30%;EHP阳性率最高(8.96%),其次是VP(2.98%)和SHIV(2.24%),WSSV最低(1.12%);产自浙江本省的虾苗阳性率最高(30.77%),产自广东(21.51%)、海南(11.54%)、福建(6.35%)的次之,产自山东的最低(0),经列联表分析方法计算χ2=13.757,表明虾苗病原携带率(阳性率)与苗种产地之间相关性极为显著;不同病原的携带率呈现不同的时间分布特征,但整体来看,6月病原阳性率相对较高,7—8月最低,均未检出。结果表明,宁波市南美白对虾虾苗存在一定程度的病原污染,其中EHP污染最为严重,产自浙江本省以及6月份的虾苗病原污染率最高,需要针对性加强防控。本研究为宁波市对虾养殖业的病害防控提供了参考。     

虾肝肠胞虫Taqman荧光PCR方法的建立与应用

为给虾肝肠胞虫(EHP)的监测和控制工作提供特异、灵敏的快速检测方法,针对EHP 18S相关保守序列设计1对特异性引物,优化并建立EHP的Taqman荧光PCR检测方法,同时验证该方法的重复性和敏感性。结果显示:体系扩增的最佳退火温度为60℃,构建好的质粒标准品标准曲线斜率为-3.195,R2为0.991;扩增产物阈值循环数(Ct)与标准模板起始量(X)的关系曲线为-3.195×Log(X)+36.923,扩增效率为105.59。使用所构建方法检测湛江市EHP流行情况,同时对样品进行白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、桃拉综合征病毒(TSV)、早期死亡综合症(AHPND)病毒检测。结果显示:样品的WSSV、IHHNV、TSV检测均为阴性;AHPND检出阳性率为10%,EHP为30%,其中1份样品的EHP和AHPND检测同为阳性。本研究建立的EHP荧光PCR方法具有特异、灵敏等优点。该方法及其临床应用数据可为EHP的防控提供技术参考。     

虾肝肠胞虫（EHP）流行病学与检测技术研究进展

近年来,虾肝肠胞虫(EHP)感染已成为对全球对虾养殖生产影响较严重的疾病之一。我国针对养殖对虾EHP感染的调查显示,该病具有较高的流行风险,是导致对虾生长缓慢的主要病原。为了解EHP的流行病学特点、检测方法和综合防治现状,结合国内外研究成果,对EHP基本特性、传播途径、致病性、检测技术和防控措施等方面的最新研究进行了综述,以期为EHP的预防和控制提供技术参考。     

2015—2017年天津市虾肝肠胞虫流行情况调查

为了解天津市对虾肝肠胞虫（EHP）流行情况，2015—2017年从汉沽区、大港区、塘沽区、宁河区、静海区、津南区和西青区等7个对虾养殖主产区，采集养殖对虾及饵料生物等样品，应用PCR法进行EHP检测。检测结果显示：在2015—2017年分别检测的79、105、140批次样品中，EHP阳性率分别为56.96%、69.52%、29.28%；在凡纳滨对虾的仔虾、幼虾、中成虾养殖阶段均可检出EHP，但幼虾、中成虾的阳性率高于仔虾；鱿鱼、沙蚕和桡足类等对虾饵料生物携带有EHP。结果表明，天津市EHP流行率呈显著下降趋势，说明严格控制亲虾品质及引进无病毒感染种苗、加强检疫监测等措施，可以有效控制EHP流行。     

虾蛋白肽对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响

研究和探讨了虾加工副产物的酶解产物(Enzymatic Hydrolysis Production,EHP)对蛋鸡产蛋率和蛋品质的影响.以虾加工副产物为原料,应用复合生物酶酶解技术制备EHP,选择产蛋率在80%以上的300日龄笼养褐壳蛋鸡288只,随机分成3组,在基础日粮中分别添加0、1.5g/100g、3g/100g虾加工副产物EHP,并替代相应重量的鱼粉,试验期为60天.EHP,可显著提高鸡蛋的哈夫单位(P＜0.05),试验组蛋鸡产蛋率平均提高3.14%,料蛋比相应低于对照组.表明虾加工副产物EHP可显著提高产蛋高峰期过后处于衰减期的鸡蛋的哈夫单位及产蛋率.     

虾肝肠胞虫LAMP检测技术的建立与应用

本试验根据虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)18S的保守序列设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出一套引物对LAMP反应体系(Bst DNA聚合酶浓度、内外引物浓度比、dNTP浓度、Mg~(2+)浓度)和反应条件(温度)进行优化。并对优化后的LAMP反应体系和条件进行特异性、灵敏度及精密度验证。特异性试验表明,该方法能特异性检测虾肝肠胞虫,而与其他病害的核酸没有交叉反应;灵敏度试验表明,可检测浓度为10 fg/μL的质粒DNA,制作的标准曲线可对虾肝肠胞虫进行定量分析。重复性试验结果表明,该方法Ct值的变异系数为2.88%～3.02%,具有良好的稳定性。而对于人工侵染的虾肝肠胞虫样品,LAMP方法可检测低至0.44 pg/μL。应用建立的LAMP方法对3个不同地区的120份凡纳滨对虾样品进行检测,检测结果表明,EHP阳性样品数为43,与qPCR检测结果符合率达97%。本试验所建立的LAMP方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,并能在30 min内完成样品的检测,是快速、定量检测虾肝肠胞虫的有效手段。     

虾蛋白肽对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响

研究和探讨了虾加工副产物的酶解产物（Enzymatic Hydrolysis Production,EHP）对蛋鸡产蛋率和蛋品质的影响。以虾加工副产物为原料,应用复合生物酶酶解技术制备EHP,选择产蛋率在80%以上的300日龄笼养褐壳蛋鸡288只,随机分成3组,在基础日粮中分别添加0、1.5g/100g、3g/100g虾加工副产物EHP,并替代相应重量的鱼粉,试验期为60天。EHP,可显著提高鸡蛋的哈夫单位（P〈0.05）,试验组蛋鸡产蛋率平均提高3.14%,料蛋比相应低于对照组。表明虾加工副产物EHP可显著提高产蛋高峰期过后处于衰减期的鸡蛋的哈夫单位及产蛋率。     

2021年浙江省宁波市南美白对虾养殖期EHP和DIV1病原监测

为了解浙江省宁波市南美白对虾主养区虾肝肠胞虫（EHP）、十足目虹彩病毒1（DIV1）的流行规律,2021年3—9月,在宁波市鄞州、象山、宁海、奉化等地区的15个养殖场共采集119批次南美白对虾养成期样本,采用PCR方法检测EHP和DIV1。结果显示：EHP批次阳性率为26.9%（32/119）,DIV1批次阳性率为10.9%（13/119）,EHP+DIV1混合感染批次阳性率为2.5%（3/119）;EHP批次阳性率在各个养殖区域之间差异不显著（P＞0.05）,象山的DIV1批次阳性率最高,为30.4%（7/23）,显著高于奉化（P＜0.05）,但与其他两地差异不显著（P＞0.05）;EHP批次阳性率在体长3 cm以上的虾样中显著高于小于3 cm的虾样（P＜0.05）,而DIV1批次阳性率在不同体长对虾中均无显著差异（P＞0.05）;EHP批次阳性率4—5月显著低于6—9月（P＜0.05）,DIV1批次阳性率7—8月显著高于其他月份（P＜0.05）;EHP在体表发红症状的批次中未检出,在其余症状的批次中均有检出,DIV1在有体表发红症状的批次中阳性率较高,为91.0%（10/11）。结果表明：EHP在宁波市流行严重,主要流行于体长大于3 cm的养殖中后期对虾,前期感染症状不明显;DIV1流行得到一定的控制,现主要流行于体长3~6 cm的对虾,体表发红是DIV1感染的重要病症;两种病原在夏季都有较强的流行趋势,需针对性加强防控。本监测初步掌握了宁波市南美白对虾中EHP和DIV1的流行规律,为宁波市南美白对虾病害防控提供了参考。     

2017年-2019年浙江台州地区凡纳滨对虾4种病原PCR检测

为了解台州地区凡纳滨对虾白斑病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病病毒(IHHNV)、高致病性副溶血弧菌(AP)和虾肝肠胞虫(EHP)的流行情况,用PCR方法对2017年-2019年采集的337个样品进行病原检测.结果表明,2017年-2019年4种病原总体携带率EHP>IHHNV>AP>WSSV;IHHNV、A...     

禽(番鸭)呼肠孤病毒TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立检测(番鸭)呼肠孤病毒(DRV)感染的方法,本研究根据DRV的σNS基因核苷酸序列设计引物及TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测方法.用已知浓度的重组质粒为标准品,构建的标准曲线的相关系数达到99%.试验表明,该方法的重复性、稳定性、特异性良好,且灵敏度高,可以检测到1.0×10~2拷贝/μL的标准品,比普通PCR至少高100倍.该检测方法对DRV人工感染番鸭肝脏组织检出率达到100%.本实验所建立的TaqMan探针荧光RT-PCR为的快速检测以及进行分子流行病学的调查提供了新的技术手段.     

鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

The study was conducted to establish the duplex Real-time PCR assay for detecting both duck tembusu virus (DTMUV) and duck plague virus (DPV). According to the sequences of DTMUV E gene and DPV UL6 gene in GenBank, two sets of specific oligonucleotide primers for DTMUV and DPV along with two TaqMan probes were designed. The duplex Real-time PCR assay was developed through optimization of reaction conditions and validation of specificity, sensitivity and repetitiveness of the method. The sensitivity of the assay were both 100 template copies for DTMUV and DPV. There was no specific bands of the same sizes were amplified from other duck pathogens, such as duck Newcastle disease virus, duck hepatitis virus, muscovy duck parvovirus, duck circovirus, H9 subtype avian influenza virus, egg drop syndrome virus. This duplex Real-time RT-PCR assay is a sensitive, quick, specific and quantitative test for detection of DTMUV and DPV, and will be useful for the control of these viruses in ducks.     

荧光定量RT-PCR法对犬瘟热病毒PS株感染犬血清和粪便中病毒的检测

为研究犬人工感染犬瘟热病毒(CDV)后病毒在血清和粪便中的含量及变化,本实验根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列设计一对特异引物,扩增NP基因.并以NP基因重组质粒作为阳性标准品,建立检测CDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法.结果表明,该方法102拷贝～109拷贝范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.998,扩增效率为E=98.3％,敏感度高,最低检测限为6.1拷贝/μL,重复性检测变异系数低于2.62％.该方法与常规RT-PCR方法比较,其敏感性提高102倍.两只人工感染CDV PS强毒株的犬,分别于接种后17d、19d发病死亡,采用荧光定量RT-PCR方法对人工感染犬的血液和拭子液中的病毒核酸栽量进行定量检测以及对收集的22份临床样本拭子液进行检测,均检测到CDV.本研究结果表明,该方法可以用于CDV核酸定量检测,为该病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供了一种快速和敏感的检测手段.     

对虾白斑综合症病毒变性高效液相色谱检测方法的建立与应用

据对虾白斑综合症病毒(WSSV)的基因保守序列,使用Primer Explorer V3软件设计了2条引物,利用PCR的扩增产物,结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立了一种对虾白斑综合症病毒的DHPLC快速检测方法。该检测方法特异性好,与传染性皮下和造血器官坏死病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾杆状病毒以及对虾基因组DNA无交叉反应;检测灵敏度较高,约为10-5ng/μL,高于常规PCR及荧光定量PCR的灵敏度。用建立的DHPLC方法对100尾对虾样品进行了临床检测,结果与荧光定量PCR检测结果一致。WSSV的DHPLC检测方法,特异性强、灵敏度高,是对WSSV进行有效检测的一种新方法。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的24株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株和5株PRRSV经典毒株的保守区基因序列,使用PrimerExpress 3.0软件设计并合成实时荧光定量PCR（Real-timeFluorescent Quantitative PCR,Real-time FQ-PCR）用引物和探针,建立了Real-time FQ-PCR检测方法以鉴别检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。用建立的检测方法对已定量的10倍倍比稀释的质粒pGET-258为标准品进行检测,并与常规PCR进行比较。结果显示,该Real-time FQ-PCR方法敏感度可达1.5个拷贝,比常规PCR敏感度高100倍,且批内和批间重复性检测结果的变异系数均小于2%。用该方法与常规PCR方法及病毒分离方法对18份临床样品进行对比检测,显示该方法灵敏度高、成本低,并且能够对样品中病毒进行定量,为高致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断提供了有效的技术手段。     

TaqMan荧光定量PCR检测鸡产蛋下降综合征病毒方法的建立及应用

根据GenBank公布的鸡产蛋下降综合征病毒六邻体蛋白基因的高度保守序列,设计了2对特异性引物和1条TaqMan探针.以构建的阳性重组质粒为标准品,绘制标准曲线,建立了一种快速检测鸡产蛋下降综合征病毒的TaqMan荧光实时定量PCR方法.该方法最小检出量达10 copies·μL-1,在1.0×102～1.0×108copies· μL-1检测范围间有良好的线性关系,特异性、稳定性和重复性也较好.用建立的本方法检测感染鸡产蛋下降综合征病毒鸡群的产蛋分离物,与普通PCR相比,该荧光实时定量PCR方法具有更高的敏感性,可更好地用于鸡产蛋下降综合征病毒的临床检测.     

牛传染性鼻气管炎病毒LUXTM新型荧光PCR检测方法的建立

本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^TM引物，建立L刚新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应，而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性，检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明，LUX^TM荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0．04TCID50，比病毒分离敏感性至少提高10倍；对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品，L刚荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10^3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中，该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40TCID50牛抗凝全血、血清和临床精液中0．04TCID50的病毒，说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUXTM荧光PCR方法快速敏感，适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。     

水疱性口炎病毒RT-LAMP快速检测方法的研究

根据逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)原理,针对水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G基因序列中的6个区域设计内外各1对特异引物,建立扩增VSV糖蛋白(G)基因的RT-LAMP方法。扩增产物电泳呈特异的阶梯状条带分布,扩增产物加SYBR GREEN I染色呈特征性的黄绿色,肉眼可直接观察判定。同时,还建立了可以进行定量检测的实时RT-LAMP方法。特异性试验显示,本方法可快速检验鉴别VSV与口蹄疫病毒(FMDV)和猪水泡病病毒(SVDV)。敏感性试验显示,建立的实时RT-LAMP方法检测VSVRNA的最低检测量为0.01 PFU,比实时荧光RT-PCR显著提高。建立的LAMP方法可检测p-VSVNJ质粒DNA的最低量为6.36×10-3pg/μL(1.4×103copies/μL),比PCR也显著提高。综合表明,本研究建立RT-LAMP检测VSV的方法具有特异、敏感、快速、简便的特点,具有开发应用前景。     

伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪伪狂犬病毒gD基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病毒的PeR引物和一条Taqman荧光探针,采用LightCycle 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1．0×10^1-1．0×10^10拷贝,灵敏度可达2拷贝,比常规PCR高100倍。该方法检测时间短,速度快,仪器的运行时间仅为1h,特异性明显高于常规PCR。对15株猪伪狂犬病毒进行了检测,结果均为阳性;与猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养和常规PeR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好的优点,可望用于,临床上伪狂犬病的检测和病毒分布的研究等。     

Real-time PCR方法和PCR方法检测虾白斑综合征病毒

由白斑综合征病毒引起的虾白斑综合征是国际兽医局（OIE）规定的必须上报的水生动物二类疫病。本研究首先通过设计新的PCR引物，提高了PCR检测白斑综合征病毒的阳性检出率。为进一步提高白斑综合征病毒检测的灵敏度，本研究采用TaqMan探针技术建立了快速检测白斑综合征病毒的real-time PCR方法，通过与常规PCR方法比较，证实其检测灵敏度显著提高。