江苏省部分地区牛羊蓝舌病血清学调查及监控

为了解江苏省蓝舌病(BT)流行现状,本研究用BTV C-ELISA试剂盒对采自江苏省9个地区的369份牛血清和202份羊血清进行BT血清学调查。结果表明,大部分地区牛群存在BT感染,并且血清阳性率存在差异,阳性率为0%~63.8%,平均阳性率为17.6%,其中以盱眙地区BTV抗体阳性率最高,部分乡镇可达100%。羊群BT感染阳性率为0%~20%,平均阳性率4.5%,低于牛群BTV感染阳性率。选择1个监控点,置BTV病原及抗体阴性小牛10头,定期监控BTV抗体变化趋势,发现自8月开始,牛BTV抗体检测出现阳性结果,至10月,监控牛群检测全为BTV抗体阳性。该研究对江苏省内蓝舌病流行情况进行了调查,建立了蓝舌病预警监测模型,为蓝舌病防控提供科学依据和技术支撑。     

2014～2016年江苏省部分地区及监控点山羊的蓝舌病血清学调查

为了解蓝舌病病毒(BTV)在江苏省羊群中的感染和流行现状,采用C-ELISA试剂盒对2014~2016年采自江苏省9个市的419份羊血清进行了BTV抗体检测,共检出BTV抗体阳性样品30份,总阳性率为7.2%。在盱眙县桂五镇选择1个监控点,建立了BTV病原及抗体阴性山羊5头的监控动物群。从2014~2017上半年,每年5~10月每周采血1次,11月~次年4月每月采血1次,并采用BTV C-ELISA试剂盒进行BT血清学监测。结果发现:每年自8月开始,羊BTV抗体检测出现阳性结果,至12月,除2014年外监控羊群检测全为BTV抗体阳性。每年5~8月采用灯光诱捕法捕捉监测点蚊蠓,发现相较2015和2016年,2014年的蚊蠓捕捉数量明显偏少。对盱眙县地理位置和历年气候变化的分析结果表明:在库蠓活动高峰时期的持续低温阴雨天气,对BTV的感染可能有严重干扰。     

2014～2016年江苏省部分地区及监控点山羊的蓝舌病血清学调查

为了解蓝舌病病毒(BTV)在江苏省羊群中的感染和流行现状,采用C-ELISA试剂盒对2014²016年采自江苏省9个市的419份羊血清进行了BTV抗体检测,共检出BTV抗体阳性样品30份,总阳性率为7.2%。在盱眙县桂五镇选择1个监控点,建立了BTV病原及抗体阴性山羊5头的监控动物群。从20142016年采自江苏省9个市的419份羊血清进行了BTV抗体检测,共检出BTV抗体阳性样品30份,总阳性率为7.2%。在盱眙县桂五镇选择1个监控点,建立了BTV病原及抗体阴性山羊5头的监控动物群。从2014²017上半年,每年52017上半年,每年5¹0月每周采血1次,11月10月每周采血1次,11月^次年4月每月采血1次,并采用BTV C-ELISA试剂盒进行BT血清学监测。结果发现:每年自8月开始,羊BTV抗体检测出现阳性结果,至12月,除2014年外监控羊群检测全为BTV抗体阳性。每年5次年4月每月采血1次,并采用BTV C-ELISA试剂盒进行BT血清学监测。结果发现:每年自8月开始,羊BTV抗体检测出现阳性结果,至12月,除2014年外监控羊群检测全为BTV抗体阳性。每年5⁸月采用灯光诱捕法捕捉监测点蚊蠓,发现相较2015和2016年,2014年的蚊蠓捕捉数量明显偏少。对盱眙县地理位置和历年气候变化的分析结果表明:在库蠓活动高峰时期的持续低温阴雨天气,对BTV的感染可能有严重干扰。     

血清15与21型蓝舌病病毒的分离与鉴定

【目的】蓝舌病病毒是一种重要的虫媒病毒,血清型较多,为了解近年来江苏省盱眙县蓝舌病病毒流行情况及血清型分别情况。【方法】本研究于2015-2016年在盱眙县桂五镇建立了5头蓝舌病血清学阴性山羊作为监控动物群。从2015年5-10月,每周采血1次,2015年11月至2016年4月,每月采血1次,用BTV C-ELISA试剂盒进行血清学监测。用RT-PCR检测转阳前2周、1周和转阳本周的血液样品,选择阳性样品处理后接种鸡胚,收获死亡鸡胚肝脏,用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏,上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21 3代进行病毒分离。阳性样品采用RT-PCR进行血清型鉴定。【结果】6月开始部分动物血清抗体转阳性,至12月,监控动物全部转为阳性。通过鸡胚、细胞传代培养共获得5个出现细胞病变的细胞培养物,经RT-PCR检测VP7基因均扩增出1156 bp片段。进一步通过RT-PCR检测VP2基因对5个分离毒株进行血清型鉴定。结果表明2株为BTV-15、3株为BTV-21。【结论】上述结果丰富了江苏省蓝舌病的流行病学资料,为蓝舌病的防控提供科学依据。     

布鲁氏菌VirB12蛋白纯化及其抗体ELISA方法的初步建立

为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最佳包被浓度为1μg·mL-1,最适封闭剂为5%脱脂奶粉,血清最佳稀释浓度为1∶25,酶标二抗最佳工作浓度为1∶1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%,表明本试验建立的以VirB12重组蛋白为抗原的ELISA方法可以检测布氏杆菌感染抗体,有望研制成试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。     

非洲猪瘟病毒无标签重组K205R抗原制备与应用

为建立敏感、特异的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,将ASFV K205R基因与类弹性蛋白多肽(ELP)进行融合表达,用相变循环纯化ELP-K205R融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,用相变循环回收K205R蛋白,用抗体阳性血清对重组K205R蛋白进行ELISA鉴定。结果表明:重组大肠埃希菌能正确表达ELP-K205R融合蛋白,相变循环纯化的融合蛋白纯度大于80%; TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,回收的重组K205R蛋白纯度大于95%,能被特异抗体阳性血清识别;重组K205R抗原与抗体阴性猪血清反应阴性,与抗体阳性猪血清反应阳性,D_(450 nm)值与血清稀释倍数具有线性相关性。用重组K205R抗原对已知猪血清进行ELISA检测,结果显示24份ASFV抗体阳性血清为检测阳性, 24份ASFV抗体阴性血清为检测阴性,检测符合率为100%。这一研究提示制备的无标签重组K205R抗原可用于ASFV抗体检测。     

广西家养反刍动物蓝舌病血清学监测分析

[目的]了解广西家养反刍动物蓝舌病毒(BTV)的感染情况,为防控广西蓝舌病(BT)提供参考依据.[方法]采用琼脂免疫扩散试验(ACID)对采自广西境内的2535份山羊血清和496份水牛血清进行BTV抗体检测,并对地理、气候因素与BTV区域分布情况进行分析.[结果]广西山羊和水牛的总BTV抗体阳性率别为36.53%和43.55%,且以南宁市的山羊、水牛BTV抗体阳性率最高,分别为78.13%和85.71%.广西家养反刍动物BTV抗阳性率呈北低南高,高海拔地区BTV抗体阳性率低于低海拔地区,气温较高的南亚热带及北热带的BTV抗体阳性率高于气温较低的中亚热带,降水充沛的东部地区的BTV抗体阳性率高于降水较少的中部和西部地区.[结论]广西家养反刍动物普遍存在BTV感染,且分布受到纬度、海拔、气温与降雨量等地理、气候因素的影响.     

自制和进口试剂盒检测鸡传染性支气管炎抗体的比较研究

用自制试剂盒和美国Affinitech-IB抗体检测试剂盒检测108份鸡血清样品,共检出阳性血清69份,其中有5份血清用自制试剂盒检测为阳性血清,而用美国Affinitech-IB抗体检测试剂盒检测为阴性。这69份阳性血清经其他试验证实为阳性。与Affinitech-IB试剂盒相比,自制试剂盒的敏感性和特异性分别为100%、88.6%。结果表明:自制试剂盒是用来检测和监测鸡血清中鸡传染性支气管炎抗体水平的一个具有敏感、特异、简便等特点的良好工具。     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

目的 建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。方法 选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。结果 三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10 μL^-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。结论 本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.     

应用间接血凝试验(IHA)诊断猪蛔虫病

以猪蛔虫抗原致敏绵羊红细胞制备检测猪蛔虫特异性抗体的间接血凝诊断试剂,与猪蛔虫抗体发生特异性凝集反应.结果表明,用间接血凝诊断试剂对3 000份猪血清进行现场检测,阳性率为30.00%;而琼脂扩散试验(AGP)的阳性率为13.00%,表明,间接血凝试验(IHA)比GAP敏感,间接血凝诊断试剂可用于猪蛔虫病的快速诊断.     

单克隆抗体夹心ELISA试验检测鸡新城疫病毒抗原的研究

从10株抗鸡新城疫病毒(NDV)特异性单克隆抗体(MAbs) 中筛选出2株MAbs—M22和F23,分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的MAbs—夹心ELISA试验,对提纯NDV的最小检出量为25ng/ml病毒蛋白.NDV鸡阳性血清对本试验的特异性阻断作用和与其他禽类病毒交叉反应的阴性结果,证明本试验对NDV的特异性。从临床疑为鸡新城疫的724只病鸡的口腔棉试样品中共检出阳性502只,其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致,两者均查出阳性鸡176只。     

左氧氟沙星人工抗原间接ELISA检测方法的建立

为检测所制备的左氧氟沙星人工抗原品质,采用西北农林科技大学兽医药理实验室制备的左氧氟沙星人工抗原免疫BALB/c小鼠,制得鼠抗左氧氟沙星人工抗原的多克隆抗体.以采集的抗血清为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗、四甲基联苯胺(TMB)为底物,建立左氧氟沙星人工抗原间接酶联免疫检测法( ELISA).试验结果表明,间接ELISA最佳反应条件为包被抗原质量浓度1 mg/L、4℃过夜、抗原抗体于37℃作用1h、酶标二抗稀释度为1∶2 000.该方法的灵敏度高,且具有良好的准确性和重复性,可以评价左氧氟沙星人工抗原的品质.     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

布鲁氏菌病微量补体结合试验的方法改进和应用

[目的]补体结合试验是布鲁氏菌病(简称"布病")血清学确诊方法.现行国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2018)中收录的补体结合试验分为常量法补体结合试验(CFT)和微量法补体结合试验(mCFT),但两者之间的相关技术参数和结果判定标准均存在差异,导致常量法CFT和mCFT检测结果不一致.笔者通...     

利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法

应用纯化的Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白作为抗原,采用过碘酸钠法标记纯化的单抗,建立了单抗竞争ELISA,检测10份阳性猪口蹄疫血清及200多份阴性血清,试验结果与样品的背景相一致。敏感性试验和重复试验结果表明,该方法具有稳定和敏感等特性,适合Asia1型猪口蹄疫病毒抗体的监测。     

血清稀释液的筛选及犬抗狂犬病病毒血清抗体正常值范围的确定

应用间接ELISA法进行抗体检测是评价狂犬疫苗免疫效果的一种快捷有效手段。首先筛选得到一种灵敏、特异的血清稀释液;然后应用其对采集自不同地区的812份未免疫犬血清稀释并进行间接ELISA检测;以OIE标准阴、阳性犬血清为对照,随机选取不同A450范围的犬血清应用RFFIT进行检测;以RFFIT效价低于0.1 IU/ml的犬血清,计算阴性血清正常值范围和95%的可信区间,并建立标准品的回归方程。结果显示：所筛选到的血清稀释液灵敏、特异,有756份血清样品的效价低于0.1 IU/ml,犬抗狂犬病抗体阴性血清的正常值范围为0.127 3±0.059 8,95%的可信区间为0.078 1-0.172 3。应用OIE犬阳性血清标准品建立了A450和抗血清效价的回归方程：A=1.139 IU＋0.470。该试验结果为犬狂犬病防制以及犬狂犬病抗体ELISA检测试剂的研制奠定了基础。     

一起放牧羊群布鲁氏菌病的分析检测

【目的】研究一起放牧羊群布鲁氏菌病(布病)分析检测方法适用性,为防治措施提供依据。【方法】采用RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA和PCR等方法检测90份来自流产羊群的血清样品,并从诊断方法的适用性特点、现场调查的结果进行统计分析。【结果】在90份羊血清样品中,RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA的阳性检出率分别为：8.89%(8/90)、12.22%(11/90)、17.78%(16/90)、14.44%(13/90)、21.11%(19/90)、25.56%(23/90)、24.44%(22/90),PCR检测出14份阳性。【结论】初筛可选用RBT、GICA、FPA或iELISA等方法,确诊选用SAT、MAT或cELISA等方法。放牧羊群布病阳性率随年龄增加呈上升趋势(成年羊42%>断奶羔羊2.5%);雌性羊布病阳性率高于雄性(雌性29.68%>雄性11.54%),有流产史的羊群患布病的风险更高,成年雌性羊更易感染布鲁氏菌。检出阳性羊进行无害化处理,羊舍和周围环境进行彻底消毒,使用布病M5-90弱毒疫苗对阴...     

生猪伪狂犬病毒gB抗体与中和抗体的相关性分析

为探索生猪伪狂犬病毒gB–ELISA抗体水平的高低与中和抗体效价的相关性,运用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对177份生猪血清进行了伪狂犬病毒gB抗体的检测,同时,用中和试验对上述血清样品进行了伪狂犬病毒中和抗体的测定。试验结果通过生物统计学分析,gE抗体阴性血清的g B抗体平均S/P值和中和抗体效价(SN效价)倒数平均值的相关系数为0.926,说明g B免疫抗体S/P值与其中和抗体效价有很好的相关性。中和抗体水平的高低一般与免疫保护力呈正相关,研究结果表明gB–ELISA抗体水平可以用来评估生猪对当前流行PRV毒株的相对免疫保护力。