布鲁氏菌病不同血清学检测方法的比较

为比较不同布鲁氏菌血清学检测方法的性能差异,本研究采用虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）、布鲁氏菌抗体快速检测试剂卡（GICA）4种常规血清学检测方法,分别对感染情况已知的87份羊血清（阳性53份,阴性34份）进行血清学检测,进而比较4种方法的敏感性、特异性与一致性。检测结果显示,BT的敏感性、特异性较为一般;GICA的敏感性较好,特异性一般;SAT与cELISA的敏感性、特异性较为良好。RBT与GICA的酸性检验结果（Kappa值）均小于0.81,与真实结果一致程度为高;而SAT与cELISA的Kappa值均大于0.81,与真实结果一致程度为极高。在临床诊断中推荐选用RBT与GICA作为初筛检测方法,对初筛检测结果为阳性的样本,结合临床症状,采用SAT与cELISA进行复核。     

动物布鲁氏菌病不同初筛及确诊方法组合检测差异性比对分析

为探讨布鲁氏菌病采用先初筛、后确诊不同方法及试剂组合检测结果的差异性，对实验室保存的133份牛、羊血清，以英国布病参考实验室RBT、SAT、APHA-cELISA方法为标准确定布病阳性血清73份、阴性血清60份。选择4种初筛方法共6种试剂、2种确诊方法共3种试剂，按照先初筛，对结果阳性样品再确诊的检测程序对确定的133份血清样品分别用6种方法(9种试剂)进行检测，结果表明：用18种组合方法检测牛阳性血清样品，符合率100%的有3种，检测结果假阴性率为0～53.33%;用12种组合方法检测羊阳性血清样品，符合率100%的有2种组合方法，检测结果假阴性率为0～50.00%。用所有方法检测牛阴性血清样品，符合率100%的有1种方法(试剂),检测结果假阳性率为0～77.78%;检测羊阴性血清样品，符合率100%的有4种方法(试剂),检测结果假阳性率为0～41.67%。应用不同的初筛、确诊组合方法检测同批样品，结果出现了多样性。建议布病初筛可优先选择iELISA、RBT、FPA,确诊可优先选择cELISA。     

羊布鲁氏菌3种检测方法效果对比试验

为了解虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、竞争ELISA(cELISA)3种血清学方法检测布鲁氏菌病的临床应用效果，通过对比分析RBT、SAT、cELISA检测结果发现，3种检测方法结果一致性、阳性率无显著性差异（P> 0.05），此外，cELISA相比RBT、SAT具有较高的敏感性和特异性。     

布鲁氏菌病不同初筛方法及诊断试剂检测差异性分析

[目的]应用布鲁氏菌病4种初筛方法及11种商品化诊断试剂检测新疆地区采集的207份牛、羊血清学样品,分析结果差异,对方法及产品进行评价.[方法]以英国参考实验室APHA竞争性ELISA试剂盒检测结果为标准,确定布鲁氏菌病牛阳性血清78份、阴性57份,羊阳性血清52份、阴性20份.应用RBT抗原(Ⅰ)、(Ⅱ),FPA抗原...     

布鲁氏菌病微量补体结合试验的方法改进和应用

【目的】补体结合试验是布鲁氏菌病（简称“布病”）血清学确诊方法。现行国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646-2018）中收录的补体结合试验分为常量法补体结合试验（CFT）和微量法补体结合试验（mCFT）,但两者之间的相关技术参数和结果判定标准均存在差异,导致常量法CFT和mCFT检测结果不一致。笔者通过对mCFT参数的改进优化,使现行标准中mCFT的检测结果等效于常量法CFT,实现布病CFT的高通量准确诊断,对现有布病检测方法进行了补充。【方法】参照布病常量法CFT反应条件和诊断标准,对现行国标中mCFT的反应时间、稀释液、效价测定方法、结果判定等相关参数进行改进优化。改进后的mCFT方法与原mCFT方法相比,效价测定中受检血清的稀释度由1﹕2—1﹕64稀释改为1﹕10稀释,稀释方法与常量法CFT相同,确保微量法的检测临界值与常量法一致;采用酶标仪读取OD₆₀₀值判定溶血强度,降低了试验人员肉眼判定的误差,提升了结果判定的效率和准确性;反应时间由37℃水浴30 min缩短为20 min,提高了检测效率又不影响检测结果;稀释液由巴比妥缓冲液改为生理盐水,与常量法使用相同稀释液并可获得理想结果。用改进的mCFT与国标的mCFT、常量法CFT分别对来自内蒙古、山东、北京、江苏等地区的409份临床牛、羊血清样品（牛血清163份、羊血清246份）进行检测,分析比较其符合率。【结果】采用改进的mCFT与常量法CFT对409份临床样品进行比对检测,改进的mCFT方法检出53份阳性、11份可疑、345份阴性;常量法CFT检出53份阳性、9份可疑、347份阴性。比较两者检测结果,只有2份牛血清样品用改进的mCFT方法检测为可疑,而常量法CFT检测为阴性,其余407份样品检测结果均一致。其中牛血清样品的符合率98.77%,羊血清样品的符合率100%,总符合率99.51%。而国标mCFT方法因阳性判定标准低于常量法CFT,且不设可疑区间,结果检出97份阳性、312份阴性。与常量法CFT结果相比较,牛血清样品的符合率88.34%,羊血清样品的符合率89.84%,总符合率为89.24%,远低于本研究改进的mCFT方法与常量法CFT 99.51%的符合率。【结论】通过对mCFT方法各参数的优化,建立了一种与常量法CFT判定标准一致,且检测结果高度符合的mCFT方法。     

科尔沁地区牛场布鲁氏菌病流行病学调查

以内蒙古科尔沁地区牛场布病疫情流行性病学检测资料为基础,重点进行布病的流行病学调查,了解布病流行情况。本研究采用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、全乳环状试验(MRT)、补体结合试验(CFT)、竞争酶联免疫吸附试验(c ELISA)、奶液间接酶联免疫吸附试验(i ELISA)方法进行筛选和确诊。结果表明,2009年共采集1360份牛血清,其中阳性血清57份,感染率为4.19%;2010年采集2175份牛血清,感染布病的牛共有129头,发病率为5.10%;2011年采集2340份牛血清,发病率为7.78%。2010年在通辽市牛布鲁氏菌病流行病学调查时共采集奶样1931份,经MRT和OIE i ELISA检测阳性率为24.39%。屠宰场牛布病总体阳性率为7.34%,而散户牛布病的总体阳性率为12.84%。通辽地区奶牛布病感染率呈现出明显的群间和区域间不均衡性。屠宰场由于检疫制度严格,阳性率明显低于散户。     

家畜布鲁氏菌病血清学调查

为深入了解云南省曲靖市罗平县家畜(猪、牛、羊)布鲁氏菌病的防控成效,于2018年8～11月从罗平县所属的13个乡、镇(街道)共采集家畜血清3089份(牛血清150份、猪血清751份、羊血清2188份)进行布病感染情况血清学检测。采用虎红平板凝集试验(RBT)进行初筛,然后进行竞争酶联免疫吸附试验确诊。结果显示, 3089份血清全部为阴性,调查数据表明,罗平县家畜布鲁氏菌病的防控取得了一定成效。     

牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体,利用纯化蛋白作为包被抗原,建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法（iELISA）。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因,将目的基因克隆入PEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-Virb8,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,利用所建立的iELISA方法对235个临床奶牛血清样本进行检测,并与虎红平板凝集实验进行比较。【结果】成功构建了含Virb8的表达载体,经多次对表达条件的优化,大量表达了目的蛋白,建立的iELISA方法具有稳定、灵敏的特点,与虎红平板凝集试验的符合率可达97.02%。【结论】所建立的iELISA方法是一种有效的牛布鲁氏菌病血清学诊断的方法,为进一步研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。     

胶体金免疫层析技术在检测乳制品中三聚氰胺的应用

【目的】基于竞争抑制免疫层析原理,建立一种快速检测乳制品中三聚氰胺的方法。【方法】在胶体金免疫层析(GICA)技术的基础上,以胶体金为标记物,建立乳制品中三聚氰胺(MA)快速检测方法、研发GICA检测试纸;验证该方法的灵敏度、重复性和特异性。【结果】所研发的GICA试纸测定乳制品中MA的检出限为40～160μg/kg,重现性好;选用11种干扰物对GICA试剂进行特异性实验,仅发现尿素、缩二脲对GICA试纸检测液态奶时存在干扰,其他9种无干扰;使用GICA、HPLC、GC-MS同时检测阴性或添加MA质量分数2.00 mg/kg的阳性乳样品,检测结果一致。【结论】GICA试纸适用于乳制品中MA的快速检测。     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

那拉提山地草甸合理放牧强度研究

【目的】明确山地草甸毒害草蔓延现状下的合理载畜量,研究不同放牧强度下草地植被特征、毒害草白喉乌头种群的变化规律。【方法】采用野外调查取样的方法,在那拉提山地草甸测定不同放牧强度(轻牧13.5只羊/hm²,中牧20.3只羊/hm²,重牧26.3只羊/hm²,极牧33.0只羊/hm²)下绵羊增重量、白喉乌头的种群特征以及草场质量指数状况。【结果】(1)随着放牧强度的增加,可食牧草的生物量、高度、盖度均呈逐渐下降的变化趋势,放牧区可食牧草生物量和草场质量指数比对照区极显著降低了32.2%~70.2%、23.6%~65.7%(P<0.01);(2)白喉乌头重要值随放牧强度的增加呈逐渐下降的变化趋势,且放牧区极显著高于对照的51.5%~114.7%(P<0.01);(3)放牧强度与单位绵羊增重、可食牧草生物量、草场质量指数呈显著(P<0.05)或极显著负相关系(P<0.01),但与白喉乌头重要值呈极显著正相关关系(P<0.01)。【结论】在毒草增生的山地草甸合理的放牧强度为20.0只羊/hm²。     

禽流感病毒感染与疫苗免疫鉴别诊断试纸条的研制及应用

 【目的】结合胶体金免疫层析技术建立一种适合养鸡业基层生产人员使用的便捷的快速诊断禽流感病毒感染鸡群的方法。【方法】将含禽流感病毒非结构基因ns1的表达载体KG-NS1转化入BL21（DE3）感受态细胞,筛选阳性克隆进行诱导表达,表达产物用GST亲和层析柱进行纯化和Western-blot分析;以NS1重组蛋白为诊断抗原,抗鸡IgFc的单抗标记的胶体金为示踪物,结合免疫层析技术,组装禽流感病毒NS1抗体的免疫胶体金鉴别诊断试纸条,评价其灵敏度和特异性,并对试验感染和临床采集的血样进行检测。【结果】NS1重组蛋白分子量约为52 kD,具有免疫学活性。在25 min内用肉眼观察到禽流感病毒感染鸡血清和NS1蛋白免疫鸡血清在试纸条的检测线处出现明显的棕红色,呈明显的阳性反应,而其它病原的血清在试纸条的检测线处不出现任何颜色,呈阴性反应。而且感染鸡群的NS1抗体在感染后3 d即可检测到,感染后1～2周为高峰期,维持时间约1周,检测阳性率为80%左右。临床样品的阳性率为9.1%。【结论】试纸条使用方便,操作简单,25 min内可以用肉眼判断结果,可区分禽流感疫苗免疫和野毒感染家禽,具有很大的推广应用价值。     

亚欧型及南非型口蹄疫一步法多重荧光RT-PCR检测方法建立

 【目的】口蹄疫是一种严重的“政治经济病”,世界各国面临的口岸疫情防控形势均十分严峻。针对南非型(SATⅠ,SATⅡ,SATⅢ型)潜在入侵中国的严峻态势,为了防止疫情跨境传播,迫切需要建立有效甄别亚欧型(A、O、C及亚洲Ⅰ型)与南非型口蹄疫的检测方法,以进一步提高防控工作的准确性。【方法】选择口蹄疫病毒(FMDV)基因组保守的5'非翻译区(5'UTR)基因为靶序列,分别设计亚欧型及南非型FMDV特异的荧光PCR引物及Taqman探针,通过对反应体系和反应条件的优化,以插入扩增目的片段的阳性克隆质粒为模板,建立多重荧光PCR检测体系;进一步以体外转录cRNA作为阳性质控品,建立亚欧型及南非型FMDV一步法多重荧光RT-PCR鉴别方法,并进行敏感性、特异性确定及田间样本检测。【结果】本研究建立的FMDV多重荧光PCR检测方法,对亚欧型及南非型FMDV阳性质粒的扩增效率均在90%以上;以倍比稀释的体外转录cRNA作为模板,进行敏感性测试表明,本方法最低可检测至7.6×10-9ng 南非型cRNA和6.3×10-8ng亚欧型cRNA;特异性试验结果显示本方法可以有效甄别亚欧型与南非型FMDV;田间样本检测结果与样品实际感染情况一致。【结论】本研究建立的FMDV一步法多重荧光RT-PCR检测方法敏感、特异而且快速,为亚欧型与南非型口蹄疫的鉴别诊断及流行病学调查提供了新的方法。     

放牧强度对高寒草地不同类群土壤动物的群落结构和多样性的影响

【目的】明确放牧强度对高寒草地生态系统中不同类群土壤动物群落结构和多样性的影响。【方法】2014年9月在川西北红原县的西南民族大学“青藏高原生态保护与畜牧业高科技研究示范基地”内选取轻度放牧（light grazing,LG,15 sheep/hm²）、中度放牧（medium grazing,MG,22 sheep/hm²）、重度放牧（heavy grazing,HG,36 sheep/hm²）及无放牧（对照）(no grazing,NG) 4个样地。使用Vortis便携式吸虫器采集地表小型节肢动物;用环刀采集0-5、5-10和10-15 cm层土样,每层采2份,分别用干漏斗法（Tullgren）和湿漏斗法（Baermann）分别分离土壤节肢动物和土壤线虫。【结果】主成分（PCA）分析结果表明,无放牧处理与其他放牧处理样地间的3类土壤动物群落结构均存在明显差异,说明放牧对土壤动物群落结构具有显著影响;而土壤线虫群落结构在3种放牧强度之间的差异最明显,其次是地表节肢动物,土壤节肢动物群落结构在3中放牧强度间的差异相对最小。3种放牧强度样地中的土壤节肢动物及土壤线虫的群落密度均显著高于无放牧处理样地(P＜0.01),而地表节肢动物群落密度则以轻度放牧样地最低。地表节肢动物的类群数随放牧强度增加而增加,但不同放强度间无显著差异（P＞0.05）;Shannon多样性指数和Pielou均匀度指数均随放牧强度的增加呈先下降后增加的变化趋势,且以无放牧处理最高,中度放牧处理最低,不同放牧强度间具有显著差异(P＜0.05)。土壤节肢动物的类群数和Shannon多样性指数均呈先增加后下降的变化趋势,且均是中度放牧强度样地的多样性显著高于其他放牧强度样地(P＜0.05);而Pielou 均匀度指数无明显变化趋势（P＞0.05）。土壤线虫的类群数以轻度放牧最高,Shannon多样性指数则是随放牧强度增加而下降,Pielou均匀度指数呈先下降后增加的趋势,以中度放牧最低,无放牧处理最高;单因素方差分析结果表明土壤线虫的多样性指数在各放牧处理间均有显著差异（P＜0.05）。多元回归分析结果表明地表和土壤节肢动物的密度和多样性指数与土壤化学性质呈显著相关（P＜0.05或P＜0.01）,土壤线虫群落密度和多样性指数与土壤化学性质和放牧强度呈显著相关(P＜0.01)。【结论】不同类群土壤动物对放牧强度的响应不同,重度放牧有利于地表节肢动物,中度放牧利于土壤节肢动物,轻度放牧利于土壤线虫。因此在评价放牧对草地生态系统的影响时选取合适的土壤动物类群非常关键。     

北方草地及农牧交错区草地植被碳储量及其影响因素

【目的】 草地生态系统在全球碳平衡中有重要的意义,草地植被碳库及其变化机制研究是植被生态学的重要命题。本文研究北方草地和农牧交错区草地植被碳密度及其空间格局,解析不同区域草地植被碳密度的关键影响因素,分析了气候、土壤、放牧等因素对地上地下植被碳库的相对贡献。【方法】 基于2002—2009年北方草地及农牧交错带草地植被调查数据,结合同期MODIS/NDVI遥感影像和1﹕100万草地类型图,建立了我国主要草地类型的生物量估算模型;整合野外考察数据和前人研究结果,探讨了研究区地上地下生物碳库及其空间格局;基于研究区255个县级行政单元,分析了不同类型草地植被碳库与气候要素、土壤要素及家畜承载量的关系,应用一般线性模型（GLM）解析了不同影响因素对草地碳密度的相对贡献。【结果】 （1）北方草地与农牧交错区草地地上平均生物碳密度为36.9 g C·m^-2,地下生物碳密度为362.9 g C·m^-2,地下生物碳密度高于地上10倍,均呈从东到西递减的趋势,频率分布图基本服从对数正态分布,不同草地类型的生物碳密度存在明显差异;（2）整个研究区及草原亚区、荒漠亚区、农牧交错亚区内,地上生物量与年降水量（MAP）呈极显著正相关、与年均气温（MAT）均呈极显著负相关,与土壤黏粒含量（Clay%）呈显著正相关、与土壤砂粒含量（Sand%）呈显著负相关,整个研究区家畜承载量与草地地上生物量之间呈极显著正相关;（3）一般线性模型（GLM）分析结果表明,年平均降水量（MAP）、年均气温（MAT）、土壤黏粒含量（Clay%）、放牧强度对地上生物量空间变异的解释率分别达到29.6%（P<0.001）、5.8%（P<0.001）、0.8%（P<0.05）、1.3%（P<0.001）;地下生物量的空间变异主要来自于年降水量（MAP）、年均气温（MAT）、土壤砂粒含量（Sand%）,对方差的解释率分别达到12.1%（P<0.001）、6.8%（P<0.001）、1.9%（P<0.005）,放牧强度没有明显贡献。【结论】 气候条件尤其是年降水量是草地生物量碳库的主要影响因素,但对地上生物量影响更为明显;土壤质地对植被生物碳库也有显著贡献,尤其对地下生物量的影响更加显著;放牧强度只能解释地上生物量变化的1.3%、对地下生物量没有显著贡献,这一发现意味着气候对生物量碳库的贡献远大于放牧影响。     

新疆巴什拜羊双羔生长发育测定

【目的】分析自然放牧条件下的巴什拜羊双羔生长发育规律,了解羔羊肉型巴什拜羊双羔的生长发育规律,为推广饲养巴什拜羊双羔提供理论依据。【方法】试验在新疆塔城地区托里县牧区进行,采用随机抽样的方法,选取出生时间相差24 h以内的巴什拜羊双羔30对,每30 d进行体重体尺的测量和记录,将所得数据输入Excel表中进行整理,并用SPSS 19.0软件进行差异性分析。【结果】公母羔羊初生时的平均体重差异不显著(P>0.05),到90 d时,公母羔羊的平均体重差异不显著(P>0.05),巴什拜羊双羔从初生到90 d性别对体重增长影响不大;巴什拜羊双羔90 d平均体重占周岁羊标准体重的三分之一,从初生到90 d公母羔羊平均日增重为公羔206 g/d,母羔186 g/d,巴什拜羊双羔具有生长发育快的特点;从初生到90 d巴什拜羊双羔生长强度为公羔85.75%~35.38%、母羔76.38%~34.69%,比同日龄巴什拜羊单羔和也木勒白羊单羔的生长强度要高且下降趋势缓慢。【结论】巴什拜羊双羔在初生至90 d性别对平均体重的增长影响不大,并且具有生长发育快、生长强度高等特点。在饲养巴什拜羊双羔时,选择牧草丰富的草场或给予一定量的补饲,可以最大限度的发挥其生长发育的潜力。     

家蚕五龄第1天与第4天后部丝腺蛋白质双向电泳图谱比较

【目的】家蚕后部丝腺是合成分泌占蚕丝总量75%～80%丝素蛋白的器官，通过后部丝腺蛋白的研究，有利于阐明家蚕分泌丝素蛋白及蚕茧优质、高产的机理。【方法】采用蛋白质双向电泳和图像分析技术，研究了家蚕不同品种五龄第1天和第4天后部丝腺细胞的蛋白质组成变化。【结果】发现各个品种五龄第1天和第4天后部丝腺细胞的蛋白质组成存在差异，但蛋白质水平的差异，远远小于从EST分析得出的基因表达水平的差异；不同家蚕品种，从五龄第1天到第4天，后部丝腺细胞的蛋白质组成的变化规律各不相同。【结论】暗示了家蚕丝素分泌的过程可能受到多种蛋白的调控，不同的品种，在调控位点及调控蛋白上存在着一定的差异，从而导致了不同品种家蚕后部丝腺细胞在分泌丝素能力上的差异。