CaM对小鼠胎儿成纤维细胞Hsp70表达的影响

[目的]证实小鼠胎儿成纤维细胞中钙调蛋白 (calmodulin,CaM) 基因参与热应激诱导型热休克蛋白70(Hsp70)的基因表达并明确其作用条件.[方法]取12.5 d孕鼠胚胎制备成纤维细胞(MEF),上述细胞随机分为对照组和热应激组:对照组在37℃条件下培养,热应激组包括I组(39℃、0.5 h),Ⅱ组(39℃,1 h),Ⅲ组(39℃,1.5 h),Ⅳ组(41℃、0.5 h),V组(41℃、1 h),Ⅵ组(41℃、1.5 h);每组3个重复.将选择的热应激组和对照组细胞分别加入不同浓度(25、50及100 mm=ol·L<'-1>)钙调蛋白拮抗剂W7,运用RT-PCR检测Hsp70、CaM mRNA表达量.[结果] 39℃和41℃热应激组Hsp70 mRNA表达量显著高于常温对照组(P<0.05):39℃应激1h的Hsp70 mRNA表达量极显著高于其它各组(P<0.01);39"C应激0.5 h和1 h CaM mRNA表达量极显著高于其它各组(P<0.01);41℃热应激组的CaM mRNA表达量与常温对照组比较差异不显著(P>0.05).在培养液中加100 mmol·L<'-1> W7、分别于37℃和39℃处理1 h后,其成纤维细胞的Hsp70 mRNA表达量极显著低于相应对照组 (P<0.01).[结论]中度热应激条件下,Hsp70和CaM基因表达量呈正相关,且39℃应激1 h可以显著诱导Hsp70和CaM基因表达;CaM通过某种途径参与了Hsp70基因表达.     

急性热应激对蛋鸭内脏组织HSP70表达的影响

选取20只处于产蛋高峰期的蛋鸭,急性热应激处理后,用RT-PCR和Western-blot研究蛋鸭各内脏器官内热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)的表达情况.结果显示:急性热应激后内脏组织肝脏、心脏和卵巢中的HSP70 mRNA和蛋白水平的表达量无明显变化,肾脏内mRNA水平的表达量显著下降,而脾脏内mRNA和蛋白水平的表达量呈短暂下降后又恢复到原来水平.结果表明当蛋鸭遭受急性热应激时内脏器官呈现特异性反应.     

肉鸡热应激下肝脏和下丘脑HSP70 mRNA的表达

研究优质黄羽肉鸡热应激期间肝脏和下丘脑组织中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)基因mRNA的动态表达规律,为揭示该类型优质鸡种热应激反应机理提供参考。64日龄Anak 40(♂)×岭南黄(♀)杂交后代母鸡置于(38±1)℃恒温室内进行持续热应激处理,采取荧光定量PCR方法分别测定热应激起始(0 h)、热应激后12、24、36、48和60 h肝脏和下丘脑组织中HSP70 mRNA的表达水平。随着热应激时间的延长,肝脏和下丘脑组织中HSP70 mRNA表达水平均显著上升,至热应激36 h时表达水平达高峰值,约为应激起始表达水平的7倍,差异显著(P<0.05);热应激48和60 h,下丘脑HSP70 mRNA表达量快速回落至热应激初期的水平,而肝脏表达量极显著地骤降至低于热应激初期10%的水平。在(38±1)℃持续热应激期间,优质肉鸡肝脏和下丘脑HSP70 mRNA表达呈现基本同步的变化规律,即表达水平先上升后下降,热应激36 h时表达水平达高峰值。     

复方中草药对大鼠热应激蛋白70mRNA的表达影响

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对热应激模型组、热应激加中草药配方一组、热应激加中草药配方二组和对照组的SD大鼠的肝组织进行HSP70mRNA表达检测,观察清热复方中草药对两种模型大鼠肝HSP70mRNA表达的影响,并以β-actin为内参照进行基因表达水平的半定量分析。结果显示热应激组中HSP70mRNA的表达高于对照组(P<0.05);热应激加中草药配方一组和热应激加中草药配方二组高于热应激组(P<0.05),但其二者之间差异不显著(P>0.05)。说明清热复方中草药可诱导热应激大鼠肝脏组织中HSP70表达量的增加,从而提高组织细胞的耐受性,避免损伤,对机体起保护作用。     

急性热应激对西伯利亚鲟肝功指标及肝脏热休克蛋白表达的影响

【目的】探究急性热应激对西伯利亚鲟(Acipenser baeri)肝脏功能的影响。【方法】将(34.905±3.761)g西伯利亚鲟从23℃水体迅速移至30℃水体中,在热应激3、6、12、24、48和96 h检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶活力(AST)和总蛋白含量(TP),并利用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测肝脏hsp70和hsp90βmRNA的相对表达量。【结果】西伯利亚鲟血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力均呈现先升高后降低的趋势,在高温胁迫48 h达到峰值。血清总蛋白和白蛋白含量整体维持恒定。肝脏hsp70和hsp90β的相对表达量均在热应激后迅速上升,在6 h达到峰值,96 h降至0时刻水平。【结论】急性热应激对西伯利亚鲟幼鱼的肝脏功能产生一定影响,但是在胁迫96 h后均恢复到正常水平;肝脏中热休克蛋白70和90均参与生理调节,以应对热应激对肝脏细胞的损伤。     

日粮添加硒对热应激条件下蛋鸡相关生理生化指标及HSP70 mRNA表达的影响

在热应激条件下,对产蛋高峰期的海兰蛋鸡分别饲喂添加有0 mg/kg、0.3 mg/kg、0.5 mg/kg、0.7 mg/kg硒的基础日粮,分别在试验第0天(试验开始前一天)、第1天、第7天、第14天和第21天的时候,对各组鸡的血清进行采样,测定样品中的三碘甲状腺原氨酸(T3)、皮质醇(CORT)含量;对各组鸡的胸肌、肝脏进行采样,测定各组织热应激蛋白70(HSP70)基因的表达量。结果显示:热应激对蛋鸡血清T3含量无显著影响,但显著提高了热应激第1天和第7天血清CORT的含量;日粮中添加硒可在一定程度上提高热应激条件下蛋鸡血清T3含量,降低CORT含量;热应激极显著地提高了海兰蛋鸡胸肌、肝脏组织中HSP70 mRNA的表达量;日粮中添加硒能极显著地降低蛋鸡胸肌、肝脏HSP70 mRNA的表达量。     

热应激条件下小鼠睾丸组织HSP70基因表达谱的研究

本试验建立了不同温度、不同时间热应激实验小鼠动物模型,采用Real-time PCR和Western-blot方法检测了小鼠睾丸组织热应激蛋白70(HSP70)在mRNA和蛋白质水平的表达规律。结果表明:25℃时,HSP70在mR-NA和蛋白质表达水平没有变化;在31℃、34℃和37℃时,随应激时间的延长,HSP70mRNA和蛋白质的表达均呈现先升高后下降的趋势;40℃时,HSP70mRNA和蛋白质始终持续高表达。结论:小鼠受热应激后,睾丸组织HSP70mRNA和蛋白质均随着温度和时间的增加呈规律性变化,本研究为探索HSP70对精液品质的影响奠定了基础。     

灯盏乙素抑制热应激诱导猪肾小管上皮细胞凋亡研究

灯盏乙素(Scu)为灯盏花中提取的单一黄酮类化合物,具有清热解毒和保护细胞免受热应激损伤的作用。试验将不同浓度Suc培养的猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)在42℃下热应激1 h,采用RNA干扰法沉默细胞HSP72基因表达,荧光定量PCR和Western blot检测细胞热休克蛋白(HSP)70、Bcl-2、Bax、细胞色素C(Cyt-c)和caspase-3裂解。结果表明,Scu显著增加细胞Bcl-2蛋白和HSP70蛋白水平,增加Bcl-2/Bax比值,抑制Cyt-c的释放及pro-caspase-3裂解和caspase-3表达;但沉默HSP70后,细胞Cyt-c释放和caspase-3表达均显著增加。由此可知,Scu抑制LLC-PK1凋亡,保护细胞免受热应激损伤。     

EGCG对急性热应激肉鸡抗氧化能力的影响

为研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对急性热应激肉鸡血清及器官抗氧化能力的影响,选取144羽10日龄淮南麻黄公鸡,随机分为3组:对照组(Ⅰ组)、急性热应激组(Ⅱ组)和急性热应激+EGCG组(Ⅲ组),每组6个重复,每个重复8羽。Ⅰ组和Ⅱ组饲喂基础饲粮,Ⅲ组饲喂在基础饲粮中添加400mg/kg EGCG的试验饲粮。至94日龄时,Ⅰ组环境温度维持为(22±1)℃,Ⅱ组和Ⅲ组升温至(33±1)℃,持续12h后,采集血清、脾脏、肝脏及空肠,用比色法检测抗氧化指标,并用实时荧光定量(qRT-PCR)法检测肝脏核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路相关基因表达水平。结果表明:1)与Ⅰ组相比,Ⅱ组肉鸡脾脏指数,血清和脾脏中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,肝脏中T-SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及Nrf2、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、CAT、GSH-Px mRNA表达量显著降低(P0.05),而空肠中丙二醛(MDA)含量,肝脏中MDA和蛋白羰基(PC)含量及Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)mRNA表达量显著升高(P0.05);2)与Ⅱ组相比,Ⅲ组肉鸡脾脏中CAT活性,肝脏中GSH-Px活性及CAT mRNA表达量显著升高(P0.05),而空肠和肝脏中MDA含量显著降低(P0.05)。综上,饲粮中添加EGCG可提高急性热应激肉鸡的抗氧化能力,进而缓解急性热应激导致的氧化损伤,其机制可能与EGCG激活Nrf2信号通路关键抗氧化基因表达有关,为EGCG应用于肉鸡生产奠定了理论基础。     

白术多糖对环磷酰胺致雏鸡肝脏细胞凋亡中线粒体通路的影响

试验旨在从线粒体介导的细胞凋亡通路,探讨白术多糖(PAMK)对环磷酰胺(CTX)诱导的雏鸡肝脏损伤的影响。试验选取1日龄岭南黄鸡240羽,随机分成4组:对照(Control)、环磷酰胺(CTX)、白术多糖(PAMK)以及白术多糖环磷酰胺联合组(PAMK+CTX)。试验结束后,采集雏鸡肝脏组织,用于形态学观察及线粒体介导的细胞凋亡通路相关基因mRNA表达量和蛋白表达水平检测。光镜结果显示,环磷酰胺诱导雏鸡肝脏组织细胞形态结构不完整、肝细胞索排列紊乱、空泡化。电镜结果显示,环磷酰胺可导致雏鸡肝脏组织细胞线粒体明显受损,并发生细胞凋亡。从分子水平探讨线粒体介导的细胞凋亡通路结果显示,环磷酰胺可导致雏鸡肝脏组织中促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax和p53 mRNA表达量显著升高(P0.05),抑凋亡基因Bcl-2mRNA表达量显著降低(P0.05)。白术多糖环磷酰胺联合组雏鸡肝脏组织中Caspase-3、Caspase-8、Bax的mRNA表达量显著降低(P0.05),Bcl-2 mRNA表达量显著升高(P0.05)。此外,白术多糖环磷酰胺联合组雏鸡肝脏组织中Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P0.05)。研究结果表明,环磷酰胺可诱导雏鸡肝细胞凋亡,白术多糖可通过调节线粒体通路相关基因表达抵抗环磷酰胺诱导雏鸡肝细胞凋亡,对雏鸡肝脏产生保护作用。     

急性热应激对草鱼肾细胞的影响

将草鱼肾细胞(CIK)在28℃条件下培养24h后,分别置于28(对照)、32、36和40℃的条件下暴露2h,测定不同温度处理组的细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞周期的改变、细胞内多泛素化蛋白水平以及caspase-3和bcl-2的表达变化;置于28(对照)、32、36和40℃的条件下暴露12h,测定不同温度处理组的细胞活力。试验结果表明,热应激引起细胞活力显著下降,导致CIK细胞的LDH漏出率显著上升,多泛素化蛋白表达量显著增加,bcl-2的表达量显著下调和caspase-3的表达量显著上调,G0/G1期细胞显著减少。急性热应激可能会引起CIK的细胞膜通透性和蛋白质表达量的变化,从而诱导细胞启动凋亡。     

抗应激中药冲剂对猪肝脏热应激蛋白70表达的影响

研究抗应激中药冲剂对高温应激下猪肝脏组织热应激蛋白70(Hsp70)表达的调控效果。选取64头3月龄中国实验用小型猪,随机分为常温对照组、高温应激组、方Ⅰ、Ⅱ组,于高温第1,3,6,10天动态取样后,分别采用免疫组织化学和ELISA法测定肝中Hsp70的蛋白表达定位定量变化。结果表明,高温应激后,猪肝脏组织细胞阳性率显著增加(P<0.05),方Ⅰ、方Ⅱ组肝脏细胞阳性率显著高于常温组(P<0.05)但低于高温组(P<0.05);ELISA方法结果显示高温组、方Ⅰ、方Ⅱ组肝脏组织Hsp70含量显著增加(P<0.05),方Ⅱ组Hsp70含量在第3,6天比高温组显著增加(P<0.05)。因此,中药抗应激冲剂可通过增加肝脏Hsp70蛋白含量水平来提高机体细胞热耐受,达到保护作用,且方Ⅱ组效果优于方Ⅰ组。     

肉鸡心脏热应激损伤和热休克蛋白mRNA转录水平的相关性

 通过分光光度计、组织病理学和荧光定量反转录PCR检测技术，研究肉鸡心脏热应激损伤和热休克蛋白mRNA 变化的相关性。试验结果显示，热应激过程中肌酸激酶和谷丙转氨酶的活性呈现波动性变化，肌酸激酶的变化更明显；心脏的组织病理学变化主要表现为心肌纤维变性和坏死；热应激过程中HSC70 mRNA也呈现波动性变化，而 HSP70 mRNA水平呈现上升趋势。结果提示，HSC70 mRNA与肌酸激酶活性变化呈现一定负相关，HSC70有可能作为心脏热应激损伤的标志物。     

持续热应激状态下肉鸡心脏和肾脏组织损伤与hsp_(60) mRNA转录

为研究环境胁迫条件下热休克蛋白60 mRNA(hsp60 mRNA)转录水平和应激性损伤的关系,将30日龄AA肉鸡的饲养环境温度从(22±1) ℃突然升高到(37± 1) ℃分别热应激1、2、3、5和10 h后剖杀,利用临床血液病理学、组织病理学和荧光定量PCR方法,观察热应激不同时间对肉鸡重要器官心脏和肾脏组织损伤及其hsp60 mRNA表达水平的影响.结果显示,持续热应激处理后的肉鸡血液肌酸激酶(CK)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)均显著升高,CK在2、3、5和10 h与对照组(无热应激)差异极显著(P<0.01),ALT在3 h与对照组差异显著(P<0.05),在5 h和10 h差异极显著(P<0.01);持续热应激处理2 h后的肉鸡心脏和肾脏组织均呈现出不同程度的以颗粒变性和水泡变性为主要特征的病理性损伤;心脏和肾脏组织中hsp60 mRNA转录水平在热应激2 h时显著高于对照组(P<0.05),而在5、10 h逐渐恢复正常.提示:hsp60 mRNA转录水平与其相应蛋白的表达和肉鸡组织的热应激损伤存在一定程度的关联性.     

热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡及其对HSP70基因表达的影响

为探讨热应激对乳腺上皮细胞凋亡的影响,以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,取对数生长期的乳腺上皮细胞分别置于39℃和41℃热处理1 h(以37℃正常培养的细胞为对照),在37℃恢复培养0、6、12 h后收集细胞,采用MTT法检测细胞生长抑制率,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,比色法分析Caspase-3活性,荧光定量PCR检测HSP70基因的表达水平。结果表明,39℃热应激组细胞生长抑制率和死亡率高峰期均发生在热修复6 h,细胞死亡率为15.42%,而41℃热应激组发生在热修复12 h,细胞死亡率高达23.18%;高温处理后,Caspase-3活性呈上升趋势;39℃热应激组在热恢复6 h,HSP70基因表达量显著高于对照组,41℃热应激组在热恢复0、6、12 h,HSP70基因的表达量分别为对照组的3.53倍、5.61倍和2.93倍。综上可知,高温应激激活了Caspase-3活性,从而诱导乳腺上皮细胞凋亡,并随高温强度的增加而作用增强,同时高温诱导了HSP70基因过表达,协助细胞获得热耐受性。     

热应激对小鼠睾丸Hsp70-2基因mRNA转录水平的影响

用半定量RT-PCR方法检测不同温度、相同时间(4 h)热应激处理小鼠睾丸组织中Hsp70-2基因的mRNA转录水平,以研究热应激对Hsp70-2基因mRNA转录的影响。结果显示,各热应激组小鼠睾丸Hsp70-2 mRNA转录水平下降,并且温度越高,其下降幅度越大。与对照组相比,33℃组小鼠Hsp70-2 mRNA相对转录水平显著(P<0.05)下降,而37℃组和42℃组下降极显著(P<0.01)。42℃组Hsp70-2 mRNA相对转录水平仅为对照组的44.7%。上述结果说明,热应激使Hsp70-2基因mRNA转录水平下降,热应激对雄性生殖机能的影响与Hsp70-2减少有关,而Hsp70-2 mRNA转录水平可以作为热应激对雄性生殖机能损伤程度的判断指标之一。     

不同温湿指数对藏獒外周血淋巴细胞凋亡及HSP70蛋白表达的影响

选择体重、年龄相近的藏獒10只,研究不同温湿指数(THI)对藏獒的生理常数、外周血淋巴细胞凋亡及HSP70蛋白表达的影响.研究结果表明:(1)夏季高温季节,随THI升高,藏獒的直肠温度和呼吸频率也逐渐升高,极显著高于春季非热应激组；(2)夏季高温热应激显著增加了藏獒外周血淋巴细胞的凋亡率,淋巴细胞早期凋亡率在THI为83.58时达到最高,与非热应激组相比差异极显著；(3)夏季高温热应激诱导外周血淋巴细胞HSP70蛋白的表达,与非热应激组相比差异极显著.结论:(1)夏季高温热应激显著提高了藏獒的直肠温度和呼吸频率；(2)热应激诱导藏獒外周血淋巴细胞发生凋亡；(3)热应激诱导藏獒外周血淋巴细胞HSP70蛋白过表达.     

热应激对猪睾丸死亡受体Fas及其配体FasL表达与定位的影响

猪睾丸内精子发生与精液质量受高温影响,但相关分子机制的报道尚未给出完整定论。利用9头14月龄性成熟长白公猪随机建立3组热应激模型,每组3头,分别为对照组、环境热应激组、局部热应激组,其中,对照组不作任何处理,室温(20～25℃)圈养在猪舍中,每天正常给水、喂食;环境热应激组每日将猪饲养在37～40℃猪舍中3 h,结束后赶回室温猪舍,连续处理7 d;局部热应激组的猪用自制的可控温加热垫覆盖在左侧睾丸阴囊表面(42℃加热1 h)。各组猪睾丸处理结束后,迅速将猪睾丸组织摘取,一部分组织切成1.5 cm3的3小块置于Bouin液固定,用于石蜡组织切片的制作;剩余部分冻存于液氮,用于总RNA、总蛋白的提取。Fas,FasL通过qRT-PCR与Western Blotting检测m RNA与蛋白的相对表达量,通过免疫组织化学染色观察生殖细胞的定位。研究旨在探索环境高温和阴囊局部热刺激导致的死亡受体Fas及其配体FasL表达与定位的影响。结果表明,qRT-PCR检验结果显示,FasmRNA相对表达量与对照组相比,环境热应激组升高、局部加热组显著升高;与对照组相比,环境加热组中FasLm RNA相对表达量显著降低、局部加热组显著升高。Western Blotting检测结果显示,与对照组相比,Fas蛋白的相对表达量环境加热组与局部加热组均升高,其中,局部加热组显著升高;与对照组比较,FasL蛋白在环境加热组的相对表达量显著降低,局部加热组显著升高。免疫组织化学结果显示,Fas免疫反应阳性物主要定位在各级生精细胞,热应激导致其阳性表达增强,且局部加热组表达量最高;FasL主要定位在支持细胞、精母细胞以及圆形精子细胞,与对照组相比,局部加热导致其表达量升高,环境加热导致其表达量降低。结果说明,局部热刺激条件下,支持细胞FasL的表达量升高,以旁分泌的方式作用于邻近生精细胞膜上的膜受体Fas,引发细胞凋亡;环境热应激组未见FasL的升高,可能是因为以不依赖于细胞凋亡通路Fas/FasL的方式进行的。     

热应激奶牛外周血淋巴细胞凋亡和bax-α基因表达

用流式细胞记录仪检测分析奶牛在夏季 (日平均气温为 37 5℃)、夏末 (日平均气温 26 5℃) 和冬季 (日平均气温 5 5℃) 时奶牛外周血淋巴细胞DNA含量, 统计细胞所处的分裂时期及淋巴细胞的凋亡率, 并通过荧光定量PCR分析上述时期外周血淋巴细胞bax α基因mRNA表达量。结果显示: (1) G2 /M期细胞和淋巴细胞增殖指数随温度降低而呈明显的下降趋势, 5 5℃时比例最低, 相对于其他两个温度条件差异显著 (P<0 05); (2) 淋巴细胞凋亡率于 26 5℃达到最高峰 (10 60% ), 5 5℃下降至最低 (2 7% ), 差异显著 (P<0 05); (3) 在 26 5℃, bax α基因mRNA表达量最高, 与其他两个温度条件相比该基因的丰度差异显著 (P<0 05); (4) bax α基因mRNA表达量与淋巴细胞凋亡率呈明显的平行关系。提示bax基因可能参与热应激引起的淋巴细胞凋亡过程。