正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（EST contig110和EST contig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列EST contig110和EST contig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对EST contig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1．2×10^6PFU／mL、重组率为93．3％、85％插入片段处于750～2000bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23．3％ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75．9％ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogenn—activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll—like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1.2×106 PFU/mL、重组率为93.3%、85%插入片段处于750～2000 bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23.3% ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75.9% ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP） 基因克隆及其同源性比较

【目的】克隆兰州大尾羊心脏型肪酸结合蛋白（H-FABP）基因全长cDNA序列,为研究绵羊H-FABP生物学作用和生产应用提供理论依据。【方法】根据已知哺乳动物H-FABP基因 cDNA 序列,设计5''和3''特异引物,运用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得兰州大尾羊H-FABP基因全长 cDNA 序列。【结果】 扩增获得兰州大尾羊5''端425 bp、3''端231 bp片段和 177 bp中间片段,拼接获得748 bp兰州大尾羊H-FABP基因全长cDNA 序列（GenBank登录号：JQ780322）。 兰州大尾羊H-FABP基因ORF长 402 bp,编码 133 个氨基酸。核苷酸序列分析显示兰州大尾羊H-FABP基因序列与大多数哺乳动物相似,但其第66位发生的碱基转换（T←→G）引起所编码的第22位天门冬氨酸（N）不同于其它所有物种的赖氨酸（K）。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与山羊亲缘关系最近。预测兰州大尾羊H-FABP蛋白质的空间结构与山羊和牛H-FABP类似,由2个α螺旋和10个反向平行的β折叠组成,10 个折叠片围成一个桶状结构,疏水性残基位于桶内,用于结合脂肪酸。【结论】克隆了兰州大尾羊H-FABP基因,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长cDNA文库构建及其EST注释与比较分析

 【目的】构建小麦D基因组供体粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，探讨利用生物信息学方法分析发掘组织特异性表达基因的可行性。【方法】本研究利用Cap-trapper方法构建全长cDNA文库，利用高通量测序技术获得大批高质量EST序列，在基于Linux系统的本地化生物信息学分析平台上对上述EST进行了电子注释分析。【结果】成功构建了粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，测序获得根EST序列6 973条和叶EST 6 616条。利用本地化数据分析平台对其进行功能注释。利用GO-Diff软件，发现了两个文库间表达基因的功能差异，找到组织间表达差异显著的基因和组织内特异性表达的基因。【结论】利用构建的全长cDNA测序获得大量EST序列，通过生物信息学方法挖掘差异表达或特异性表达基因的方法是可行的。     

冀228纤维均一化全长cDNA文库的构建与鉴定分析

【目的】构建优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,降低纤维中存在的高峰度基因的拷贝数,提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。【方法】以优质陆地棉冀228开花后8-40 d纤维为材料,将纤维全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了棉花纤维的非剪切型全长cDNA原始文库。利用均一化技术获得均一化全长cDNA文库,进而测序获得大量的EST序列。采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接、比对、COG功能注释和GO注释。【结果】构建了优质陆地棉冀228纤维均一化全长cDNA文库,该文库初级文库库容为1.06×10⁷,初级文库的滴度为3.56×10⁶ cfu·mL^-1,平均片段长度为1.2 kb。qRT-PCR检测均一化程度结果表明,棉花2个高峰度表达基因在该文库中的表达量均下降了1 000倍。随机选取2 384个克隆进行单向测序,获得2 169条高质量的表达标签（EST）,拼接成1 745个单一基因（Unigene）;同源比对分析表明,70%的Unigenes与已知功能基因具有较高的同源性。基因进行COG功能分类结果显示,较多的COG功能分类集中在“翻译、核糖体结构和生物转化”、“碳水化合物运输与代谢”和“翻译后修饰、蛋白转移及蛋白伴侣”功能上。根据基因的GO注释结果,参与细胞构成、细胞器和膜构成的基因比例最高,参与细胞过程和新陈代谢等过程的基因比例较高,具有结合和催化功能的基因较多,这些基因可能在棉纤维发育中发挥比较重要的作用。【结论】构建了优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,经文库质量检测、均一化程度检测和随机选取克隆的测序分析结果表明,文库的代表性和重组片段的完整性均达到了分离筛选目的基因的建库要求,整个文库有着很高的非冗余性。构建的cDNA文库具有既能获得与已知序列同源性很高的基因,又能挖掘出优质陆地棉冀228特有的基因或同源序列的作用,能够提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,将为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建及质量初检

为了筛选中华绒螯蟹Eriocheir sinensis血细胞免疫的相关基因,促进蟹类免疫防治的进展,采用Gubler-Hoffman法构建了中华绒螯蟹血细胞的cDNA文库。结果表明：该文库初始滴度为4.50×106cfu/mL,库容为3.3×106cfu/mL,重组率为73%,插入片段大小多为800~2 500 bp。随机挑取了94个重组子进行测序初检,共得到93条平均长度为511 bp的表达序列标签（EST）序列,对所测EST序列进行拼接,得到75条一致性序列,包括15条重叠群（Contigs）和60条单一序列（Singleton）。对测序结果进行比对分析,获得了15条已报道有一定功能的一致性序列,其中4条与免疫相关;另外60条一致性序列还未见报道。研究表明,中华绒螯蟹血细胞cDNA文库已构建成功,且质量较高,从而为开展中华绒螯蟹功能基因克隆、分析和功能基因组学研究奠定了基础。     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。     

扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白(PICK1)基因的克隆及序列分析

[目的]分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Monieziaexpansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因蛋白激酶C相互作用蛋白,全长1 527 bp,编码447个氨基酸,CDS预测存在明显的BAR,PDZ结构域.编码蛋白的理论分子质量为50.173 3 ku,等电点为5.22.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础.     

利用SSH技术鉴定黄瓜胚胎发育相关基因

【目的】寻找黄瓜胚胎发育早期和胚胎发育晚期优势表达基因,研究其胚胎发育的分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建胚胎发育早期和晚期差异表达cDNA文库。【结果】经反向Northernblot杂交检测,共得到97个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接,共得到93个UniESTs,其中包括86个singletons和7个contigs。将上述EST序列在GenBank上进行BLAST比对,有83个EST片段找到了与之匹配的同源序列,有10个EST片段未找到同源序列,推测可能是新基因。【结论】其中很多EST与拟南芥、水稻或玉米蛋白质数据库中的热激蛋白具有很高的同源性。将以上序列应用GeneOntology进行功能分类,发现在胚胎发育早期细胞防御和代谢过程占主要位置;在胚胎发育晚期细胞防御和抗渗透胁迫功能是非常重要的。     

C57BL/6和A/J两品系小鼠脾脏消减cDNA文库的构建及差异基因分析

【目的】检测健康C57BL/6和A/J小鼠常规免疫指标,构建脾脏消减cDNA文库并筛选差异表达基因,以探讨两品系小鼠对猪链球菌抗病性差异的分子机制。【方法】利用ELISA法检测血清常规免疫指标,抑制性消减杂交（suppression subtraction hybridization,SSH）技术构建8周龄小鼠脾脏差异表达基因的cDNA文库。【结果】试验结果表明,A/J品系小鼠血清中IgA水平明显高于C57BL/6品系小鼠（P＜0.05）,而血清IgG和IFN水平在两品系小鼠间均无显著差异。对筛选的149个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后获得56条差异表达序列标签（ESTs）。利用Genebank的BLAST分析核酸和蛋白质同源性比较,26个不同的基因或ESTs具有高度的同源性,2条ESTs未找到同源序列。【结论】筛选到很多EST与信号转导、细胞凋亡及免疫等重要功能基因高度同源,为研究猪链球菌的致病机理和防治提供了实验依据。