大麻哈鱼SRAP反应体系正交设计及优化

以大麻哈鱼基因组DNA为模板,利用相关序列多态性(SRAP)技术以及L25(56)正交试验和单因子试验方法,分析了不同浓度的TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、Mg2+、DNA模板对扩增结果的影响,最终确立的PCR最佳反应体系为15μl,该体系含有1×PCRbuffer,TaqDNA聚合酶0.75U,引物浓度0.3μmol/L,dNTPs浓度0.3mmol/L,Mg2+浓度2.5mmol/L,DNA模板100ng。利用此优化反应体系,获得了清晰、稳定、多态性高的DNA谱带。     

罗非鱼TRAP分子标记反应体系优化设计方案的比较

靶位区域扩增多态性（target region amplification polymorphism,TRAP）是一种新型功能性分子标记,比较了L16（4^5）正交试验和单因素方法优化罗非鱼（Oreochromis spp．）TRAP反应体系。2种分析方法结果中dNTPs浓度、随机引物浓度、DNA浓度相同而镁离子（Mg2＋）浓度和TaqDNA聚合酶浓度不同,不同因素间存在一定的交互作用。正交设计方法比单因素法更简单、科学、合理。该试验获得罗非鱼15txLTRAP最优反应体系为DNA模板浓度为60ng、Mg2＋浓度为1．5mmol·L^-1、dNTPs浓度为0．3mmol·L^-1、TaqDNA聚合酶0．5U、随机引物浓度为7pmol·L^-1和固定引物浓度为10pmol·L^-1。该反应体系在4个罗非鱼群体中验证,表现出良好的稳定性和重复性,该反应体系的建立为TRAP标记应用于罗非鱼遗传多样性评价、种质鉴定、分子标记辅助育种等研究提供了新的手段。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料,研究了Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶,以及退火温度对RAPD反应的影响,建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系。反应总体积为20μL,Mg2+浓度为2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶浓度为1U,引物浓度为2μmol/L,dNTPs浓度为400μmol/L,模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序:94℃预变性2min→40循环(94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃延伸5min。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料，研究了Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶，以厦退火温度对RAPD反应的影响，建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系，反应总体积为20μL。Mg^2＋浓度为2．5μmol／L，TaqDNA聚合酶浓度为1U，引物浓度为2μmol／L，dNTPs浓度为400μmol／L．模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序：94℃预变性2min→40循环（94℃变性1 min→36℃退火1min→72℃延伸lmin）→72℃延伸5min．     

鳡鱼ISSR-PCR反应体系的正交优化

利用正交试验设计的方法,对鳡鱼ISSR-PCR反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度、DNA模板浓度及Taq DNA聚合酶浓度进行优化分析。建立了最佳ISSR-PCR反应体系,即25μL反应体系中含Mg2+2mmol/L、引物0.4μmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、模板DNA 100ng、Taq DNA聚合酶1.0U。并在此基础上对退火温度和循环次数进行梯度试验,得到最佳退火温度为52℃,最佳循环次数35次。     

拟穴青蟹ISSR-PCR条件的优化

分析DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶及甲酰胺、二甲基亚砜等对拟穴青蟹ISSR-PCR反应的影响.研究结果确定了获得清晰条带的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶的浓度范围分别为:模板DNA 8～50 ng/μl ,Taq DNA聚合酶0.75～1.0 U, Mg2+1.0～2.0 mmol/L(与引物密切相关),dNTP 0.15～0.20 mmol/L,引物浓度0.6～0.8 μmol/L.甲酰胺的添加并不能优化拟穴青蟹ISSR-PCR反应结果,而低浓度的二甲基亚砜可提高扩增产物的清晰度,但与引物相关.     

三疣梭子蟹微卫星多重PCR技术建立及条件的优化

选择三疣梭子蟹22个多态性高的微卫星标记,经过引物间的搭配、组合测试以及反应条件的优化(退火温度、Mg2+含量、dNTPs的浓度等参数),构建了多重PCR扩增技术体系.本研究最终建立了47个二重PCR组合,并在47个二重引物的组合基础上建立15个三重PCR组合,3个四重PCR组合.该多重PCR技术体系的建立为三疣梭子蟹品种选育、种系评估提供快速、有效分子检测技术.     

西施舌基因组DNA的提取及其RAPD反应条件的优化

通过实验比较获得了一种高效、简便的西施舌基因组DNA的提取方法,以该法提取的基因组DNA为模板,对西施舌RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了研究,初步确定了适于西施舌RAPD分析的最佳反应体系:25μL反应体系中,含模板DNA 25 ng,10×PCR缓冲液2.5μL,dNTPs 0.3 mmol/L,MgCl22.5 mmol/L,引物15 ng,Taq DNA聚合酶1.5U。     

合浦珠母贝DNA的抽提和RAPD反应体系的优化

分别从保存于-70℃和95%乙醇的合浦珠母贝组织提取总DNA。结果表明,乙醇保存标本用双蒸馏水预处理后所提的DNA与-70℃保存的标本所提的DNA质量均较好。用抽提的DNA为模板优化RAPD条件,得到适合于合浦珠母贝的RAPDPCR反应条件为:20μL反应体系中包括20ngDNA模板,1×PCRBuffer,0.1mmol·L-1dNTPs,2.5mmol·L-1MgCl2,0.2μmol·L-1引物,1UTaqDNA聚合酶。最佳退火温度40℃。PCR产物用非变性PAGE银染和琼脂糖EB染色检测所得到的主要带型相同,但PAGE能检测到更多的多态带。     

刀鲚RAPD分析条件的优化

以刀鲚基因组DNA为模板,对刀鲚RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度,dNTPs浓度、引物浓度进行了研究。研究结果初步确定了适用于刀鲚遗传多样性分析的RAPD反应体系为:25μl反应体系中,含10×PCR缓冲液2.5μl,模板DNA20ng, dNTPs0.1m mol/L,Mg~(2+)2.5m mol/L,引物0.4μ mol/L,Taq DNA聚合酶1U。     

青鱼ISSR-PCR反应体系的建立及优化研究

以赣江野生青鱼(Mylopharyngodon piceus)基因组DNA为试验材料,研究Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和模板浓度4个参数对ISSR-PCR反应的影响,建立一套适合青鱼ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明,在25μL的反应体系中,Mg2+、dNTP、引物和模板4个参数的最适宜浓度分别为:3.0mmol/L、0.25mmol/L、0.4umol/L和30ng。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃30s,52℃45s,72℃2min,共38个循环,最后72℃继续延伸10min。     

超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中亚甲基蓝及代谢物

建立了超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时检测水产品中亚甲基蓝及其代谢物的分析方法。经过条件优化,试样用10 mL乙腈提取3次,并在体系中添加盐酸羟胺、对甲苯磺酸等提高提取效率,提取液经对丙磺酸固相萃取小柱净化,按V（乙腈）：V（乙酸铵,1 mol·L-1）=1：1洗脱,采用Thermo Hypersil C18色谱柱,以甲醇和0.2%甲酸为流动相进行梯度洗脱分离,电喷雾离子源（ESI）,正离子模式,采用选择反应监测（SRM）扫描模式。结果表明,亚甲基蓝及代谢物（天青A、天青B、天青C）在0.50-100.00 μg·L-1范围内线性关系良好,相关系数R〉0.99,在10 min内实现分离,3个加标水平（2 μg·kg-1、4 μg·kg-1、10 μg·kg-1）的平均回收率为74.23%-94.40%（n=6）,相对标准偏差（RSD）为1.13%-10.28%,检测限（LOD）为0.40~0.60 μg·kg-1,定量限（LOQ）为2.00 μg·kg-1。该方法简便快捷、准确度高,易于推广应用,可作为快速测定水产品中亚甲基蓝及其代谢物的有效方法。     

几种金属离子对沼泽红假单胞菌2-8生长和亚硝酸盐消除的影响

在培养基中添加一定浓度金属离子,研究了不同浓度铜离子（Cu2＋）、镁离子（Mg2＋）、锌离子（Zn2＋）、铁离子（Fe3＋）和锰离子（Mn2＋）对沼泽红假单胞菌（Rhodopseudom onas palustris）2-8株生长和亚硝酸盐消除能力的影响。结果发现,1×10-7mol.L-1Cu2＋刺激菌株生长和亚硝酸盐消除,1×10-4mol.L-1Cu2＋抑制生长和亚硝酸盐消除,1×10-6mol.L-1和1×10-5mol.L-1的Cu2＋抑制生长,但刺激亚硝酸盐消除;1×10-4mol.L-1Mg2＋刺激菌株生长和亚硝酸盐消除;不同浓度Zn2＋对菌体生长影响不显著,但浓度为1×10-6mol.L-1和1×10-7mol.L-1时刺激亚硝酸盐消除,浓度大于1×10-6mol.L-1时抑制亚硝酸盐消除;Fe3＋促进生长,浓度越高生长越好,对菌株亚硝酸盐消除的影响则刚好相反;不同浓度Mn2＋均抑制菌株生长,1×10-6～1×10-3mol.L-1Mn2＋抑制亚硝酸盐消除。受测定的5个金属离子中除1×10-4mol.L-1Cu2＋对菌株亚硝酸盐消除能力的抑制较强外,其他离子的抑制会随时间推移逐渐消失。     

甲醛对中华虎头蟹Ⅱ期潘状幼体的急性毒性

在盐度28．0～29．0、水温23—24℃和pH8．6～8．7条件下,采用急性毒性试验方法研究了甲醛溶液（37．O％～40．0％）对中华虎头蟹（Orithyia sinica）Ⅱ期溢状幼体的急性毒性。结果表明,甲醛溶液对溢状幼体的24h、48h,及96h的半致死质量浓度分别为131．0μL·L-1、110．3μL·L-1,及98．7μL·L-1;安全浓度为23．4μL·L-1。     

甲氰菊酯对鲤鳃Na^＋-K^＋-ATP酶活性及组织损伤的影响

采用半静止染毒法,探讨甲氰菊酯对鲤（Cyprinus carpio）的急性毒性和对鳃组织Na＋-K＋-ATP酶活性的影响及组织的病理损伤。急性毒性结果表明,甲氰菊酯对鲤的96 h半致死质量浓度（LC50）为8.53μg·L-1,安全质量浓度（SC）为0.853μg·L-1。设置1/2 96 h LC50以下的5个质量浓度0、0.43μg·L-1、0.85μg·L-1、1.71μg·L-1、4.27μg·L-1作用于鲤21 d,分别在第1、第3、第7、第14和第21天采集组织样品进行酶活测定以及组织病理学观察。结果表明,鳃组织中Na＋-K＋-ATP酶活性随着暴露时间的推移其动态变化呈先下降后上升、之后又有所回落的趋势。暴露第3天各组酶活性降至最低点,与对照组相比差异极显著（P〈0.01）,其抑制率分别达到42.49%、27.48%、59.03%和46.31%;第14天各组酶活达最高值并显著（P〈0.05）或极显著（P〈0.01）高于对照组;第21天除最高浓度组显著低于对照组外,其余3组仍高于对照组。H-E染色显示,鳃组织学损伤主要是鳃小片扭曲,上皮细胞和柱状细胞脱落,鳃小片毛细血管扩张充血,粘液细胞和基部细胞增生,严重时鳃小片粘连,呈棍棒状病变。以上损伤具有剂量相关性和时间积累效应。     

管角螺稚贝对亚硝酸盐耐受力研究

水温29℃时研究了管角螺（Hem ifusus tuba）稚贝[壳高（1.22±0.14）mm]在不同盐度和pH下对亚硝酸盐毒性的耐受力。试验结果表明,pH和盐度越低,亚硝酸盐对稚贝的毒害作用越大。水体pH为6.7、7.3、8.0和8.8时,亚硝酸盐对管角螺稚贝的96 h半数致死质量浓度（LC50）（95%可信区间）分别为188 mg.L-1（167～213 m.gL-1）、213 m.gL-1（195～231 m.gL-1）、254 m.gL-1（231～271 m.gL-1）和304 m.gL-1（284～321 m.gL-1）,相对应的安全质量浓度（SC）为18.8 mg.L-1、21.3 m.gL-1、25.4 mg.L-1和30.4 m.gL-1,pH8.8时亚硝酸盐对稚贝的SC是pH 6.7时的1.6倍;盐度在16、19、23和28时,亚硝酸盐对管角螺稚贝的96 hLC50（95%可信区间）分别为151 m.gL-1（138～178 m.gL-1）、171 mg.L-1（159～192 mg.L-1）、265 mg.L-1（246～282 m.gL-1）和296 m.gL-1（278～323 m.gL-1）,相对应的SC分别为15.1 m.gL-1、17.1 m.gL-1、26.5mg.L-1和29.6 m.gL-1,盐度28时亚硝酸盐对稚贝的SC是盐度16时的近2倍。     

超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定鱼类加工品中12种杂环胺类化合物

建立了超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定鱼类加工品中12种杂环胺类化合物（HAAs）的分析方法。经过条件优化,肉样选用乙酸乙酯、氨水和三乙胺提取,提取液经MCX固相萃取小柱净化,按V（甲醇）∶V（氨水）=9∶1洗脱,采用Thermo Hypersil Gold C18色谱柱,以甲醇和5 mmol.L-1乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱分离,电喷雾离子源（ESI）,正离子模式,采用选择反应监测（SRM）扫描模式,内标法进行定量分析。结果表明,12种HAAs在1.0～100.0μg.L-1范围内线性关系良好,相关系数R〉0.99,在12 min内实现分离,3个加标水平的平均回收率为42.98%～125.00%（n=6）,相对标准偏差（RSD）为1.49%～9.88%,检测限（LOD）为0.3～1.0μg.kg-1。该方法简便快捷,准确度高,易推广应用,可作为快速测定鱼类加工品中多种HAAs的有效方法。     

Hg（2＋）对5种鳗鲡白仔急性毒性影响的研究

以日本鳗鲡（Anguilla japonica）、欧洲鳗鲡（A.anguilla）、印尼鳗鲡（A.bicolor pacifica）、菲律宾鳗鲡（A.m orm orata）和美洲鳗鲡（A.rostrata）5种鳗鲡白仔为试验对象设计急性毒性试验,研究了汞离子（Hg2＋）对5种鳗鲡白仔的致死作用和种间差异,试验时间为96 h。结果表明,Hg2＋对5种鳗鲡白仔的24 h半致死质量浓度（24h LC50）依次为日本鳗鲡（0.408 mg.L-1）〉欧洲鳗鲡（0.179 mg.L-1）〉美洲鳗鲡（0.111 mg.L-1）〉菲律宾鳗鲡（0.052 mg.L-1）〉印尼鳗鲡（0.018 mg.L-1）。而48 h、72 h和96 h的LC50依次为日本鳗鲡〉美洲鳗鲡〉欧洲鳗鲡〉菲律宾鳗鲡〉印尼鳗鲡。日本鳗鲡和美洲鳗鲡表现出较强的耐受性,养殖水体应严格限制Hg2＋的输入。