基于正交试验设计优化三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系

相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism,SRAP）是一种多态性高的新型分子标记,其扩增结果稳定,容易操作和引物通用性高,在遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建等方面的广泛应用逐渐从植物转移到水产动物中。为了建立三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）SRAP技术体系,文章利用正交设计L16（45）对三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系的5因素[TaqDNA聚合酶、镁离子（Mg2＋）、模板、三磷酸脱氧核苷（dNTPs）和引物]在4个水平上进行优化试验,结果得出各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板（纯度1.75~1.90,质量浓度10~70ng.μL-1）,Mg2＋（1.60~2.00mmol.L-1）,dNTPs（0.10~0.40mmol.L-1）,TaqDNA聚合酶（0.50~2.00U）和引物（0.10~0.40μmol.L-1）;筛选出各反应因素的最佳水平,建立三疣梭子蟹SRAP-PCR反应的最佳体系（25μL）为TaqDNA聚合酶0.50U,Mg2＋2.20mmol.L-1,模板DNA10ng,dNTPs0.20mmol.L-1,引物0.20μmol.L-1。这一优化体系可望在三疣梭子蟹遗传多样性和性别连锁标记等研究中应用。     

三疣梭子蟹线粒体基因组单核苷酸多态性

为获得三疣梭子蟹线粒体全基因组(mt DNA)SNP突变位点,本研究针对其mt DNA全序列设计了179对引物,采用高分辨率熔解曲线(HRM)检测技术对SNP进行了筛查。在179对引物中,有89对引物具有特异性扩增结果;进一步研究表明,89对引物中共有22对引物的扩增区域含有SNP突变位点,共包含24个SNPs。统计结果显示,三疣梭子蟹线粒体基因组中的SNP分布频率为0.15/100 bp,其中转换突变比例为79.1%、颠换突变比例为16.6%;C/T(G/A)突变比率为79.1%、G/T(C/A)突变比率为8.3%、A/T突变与G/C突变的比率均各占4.16%。本研究中所获得的SNP位点分布于三疣梭子蟹线粒体基因组的11个区域,且分布不均。其中COX1基因区域的SNP数目最多,其次在D-LOOP、ND1基因区域分别为3和4个SNP位点;而t RNA、12S r RNA等其他区域尚未发现突变位点。本研究所建立的三疣梭子蟹线粒体全基因组SNP的快速筛查方法及发现的SNPs,为进一步开展三疣梭子蟹种质遗传资源多样性、增殖放流标记等方面的研究提供了分析工具。     

不同地理群体三疣梭子蟹mtDNA本底甲基化水平分析

利用重亚硫酸盐测序法,对适于三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)线粒体基因组甲基化分析的BSP(Bisulfite sequencing PCR)引物进行了筛选,在设计的21对引物中,获得了12对BSP引物。利用这12对引物分析了三疣梭子蟹海州湾群体(江苏连云港)和莱州湾群体(山东东营)线粒体基因组本底甲基化水平,结果表明:海州湾群体不存在甲基化现象,莱州湾群体发现了2个个体在ND2基因(NADH脱氢酶亚基2)位点存在甲基化现象;在存在甲基化的个体中,甲基化类型主要为CHG和CHH类型,还有少量Cp G类型。该研究结果说明,莱州湾群体和海州湾群体线粒体基因组本底水平上的甲基化特征存在一定差异,相关研究值得进一步深入探讨。     

三疣梭子蟹线粒体基因组SNP在增殖放流家系识别中的应用

为开发三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)增殖放流分子标志技术,本研究在前期获得三疣梭子蟹线粒体基因组24个SNP位点的基础上,采用高分辨率熔解曲线(HRM)检测技术对4个用于增殖放流的家系(A、B、C和D)(代表约80~120万个放流个体)进行了鉴别工作。结果显示,含有SNP位点的22条PCR扩增序列中,有9条SNP位点扩增产物在亲代(母本)及其子代的28个个体之间具有基本一致的熔解峰,且子代个体间Tm的均一性较好,无明显差异;进一步以序列已知的野生型及其突变体作为同一SNP引物扩增片段,在各家系间分析HRM标准曲线,这9个SNP可以成功用于三疣梭子蟹4个放流家系的鉴别。在这9个SNP位点中,可鉴定C家系的有5个,可鉴定B家系的有2个,可鉴定A、D家系的各1个。该研究结果为三疣梭子蟹种质资源的鉴定及标志放流工作的开展提供了技术支持。     

三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建与群体遗传分析

采用富集文库-菌落原位杂交法分离了30个三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星标记.三疣梭子蟹基因组DNA经HaeⅢ酶切连接后.用固定了((AC)15和(AG)15探针的尼龙膜((Hybond N+)捕捉含有微卫星的片段.转化至大肠杆菌DH5α中.构建三疣梭子蟹微卫星富集文库.菌落原位杂交后.任意选取150个克隆进行测序.阳性克隆率为85.48%.利用软件设计了105对微卫星引物.筛选到稳定扩增标记56对.采用30个三疣梭子蟹个体进行多样性评价.30个位点均表现出多态性.观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量(PIC)的范围分别为0.2222～1.000 0、 0.4367～0.9099和0.350～0.892.本研究筛选的微卫星位点将为下一步三疣梭子蟹遗传多样性分析、家系分析、遗传图谱构建和QTL定位等研究提供基础依据.     

三疣梭子蟹多态性微卫星DNA标记的筛选及评价

根据前人FIASCO方法构建的三疣梭子蟹微卫星富集文库,对含微卫星的DNA序列设计了71对引物并对其进行了多态性筛选,筛选出21对多态的微卫星引物,对三疣梭子蟹1个野生群体的30个个体进行遗传多样性检测,同时对引物进行评价。21个位点共获得了188个等位基因,平均每个位点扩增得到8.9个等位基因。不同引物获得的等位基因数差异较大,从3～13个不等,其中Pot8、Pot37、Pot48、Pot53、Pot54、Pot66六个位点分别获得了11、12、12、11、13、11个等位基因,而Pot46仅获得了3个等位基因。等位基因的大小分布在131～312bp,基本符合引物设计时理论产物长度。21个微卫星位点的期望杂合度的范围为0.659～0.889,PIC值均高于0.5,表明它们都有很高的杂合度,均可用于三疣梭子蟹种群遗传结构分析,为三疣梭子蟹品种选育、种系评估提供更多的微卫星DNA信息。     

三疣梭子蟹Portunus trituberculatus(Miers)生态学及池塘养殖技术研究

目前,三疣梭子蟹在我国沿海各省均开展了人工养殖,本文对三疣梭子蟹生态学及池塘养殖技术研究进行综述.提出了三疣梭子蟹今后研究的方向.     

东海三疣梭子蟹成熟群体生殖特征和条件状况

为了探求东海三疣梭子蟹成熟群体的发育生殖机制,采用生态学、资源生物学等相关研究方法,通过对三疣梭子蟹性腺、肝胰腺及条件指数等指标的研究,初步建立起雄性三疣梭子蟹成熟阶段发育分期的特征变化,反映了目前东海三疣梭子蟹成熟群体的生殖特征和条件状况。三疣梭子蟹生殖群体由1龄蟹为主,规格偏小。头胸甲宽主要分布在100~160 mm之间,体重为50~200 g。头胸甲宽与长呈线性相关,而头胸甲宽、长与体重则呈幂函数关系。成熟阶段输精管发育程度和头胸甲宽正显著相关。根据三疣梭子蟹输精管的粗糙程度、管径及管重大小,本文首次提出把处于成熟阶段的雄蟹分为5个阶段。输精管重增长为幂函数方式,输精管指数则随发育线性增长。雌蟹卵巢发育规律和头胸甲宽之间关系不甚明显,而和季节相关。研究表明,9月份三疣梭子蟹交配后卵巢迅速发育,增长明显,10~12月份生殖群体卵巢普遍处于Ⅱ~Ⅳ期。三疣梭子蟹肝胰腺重量随体重和甲壳的增长而增加,而肝体指数相反。雌蟹卵巢Ⅱ期阶段梭子蟹肝胰腺重量最高,平均重量为18.21±5.68 g,随后逐渐降低,说明肝胰腺能量发生了转移;相比于雄蟹,雌蟹储能更多。雌蟹卵巢重量随肝胰腺重量变化呈对数关系增长,而雄蟹输精管重随肝胰腺重呈线性。三疣梭子蟹生殖群体在发育变化过程中两个条件指数基本处于一个平衡阶段,雌雄间差异变化不大。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3基因克隆鉴定及表达分析

为初步研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3的生物学功能,利用特异性引物扩增和SMARTTM RACE技术克隆获得三疣梭子蟹PtCht3基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析.结果显示,三疣梭子蟹PtCht3基因全长为1409 bp,对PtCht3基因序列推导出的氨基酸序列进行分析可知,该基因编码由394个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量为43.67 kDa,理论等电点为4.80.PtCht3蛋白亲水性总平均数为-0.097,属于稳定蛋白.同源性和系统进化分析发现,PtCht3与日本仿长额虾(Pandalopsis japonica)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)几丁质酶3的同源性分别为54％和53％,与其他甲壳动物几丁质酶3聚为一支.RT-PCR显示,PtCht3基因具有较强的组织表达特异性,在肝胰腺中的相对表达量最高,在三疣梭子蟹蜕皮前期表达上调,低盐胁迫后在鳃和肝胰腺中表达量出现了波动,总体呈先上升后下降的表达趋势.推测PtCht3可能在三疣梭子蟹消化和蜕皮过程中发挥重要作用,参与三疣梭子蟹渗透压调节进程.本研究为三疣梭子蟹几丁质酶的功能研究提供了重要信息.     

三疣梭子蟹抗乳化病相关基因的初步研究

在梭子蟹疾病高发季节,从宁波市梅山岛养殖场分别采集了三疣梭子蟹幼蟹得乳化病即将死亡个体10只和健康个体8只,用RAPD技术对此18个个体的进行了检测.从加个随机引物中筛选出6个,对每只梭子蟹的DNA进行扩增.结果表明,每个引物扩增出2～8条清晰可辨且重复性强的条带,并在引物S96对2组蟹的检测结果中,从得病组里得到了1条分子量在847bp左右的特异性条带,进而推测此条带应与抗乳化病能力的强弱有关.