拟穴青蟹ISSR-PCR条件的优化

分析DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶及甲酰胺、二甲基亚砜等对拟穴青蟹ISSR-PCR反应的影响.研究结果确定了获得清晰条带的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶的浓度范围分别为:模板DNA 8～50 ng/μl ,Taq DNA聚合酶0.75～1.0 U, Mg2+1.0～2.0 mmol/L(与引物密切相关),dNTP 0.15～0.20 mmol/L,引物浓度0.6～0.8 μmol/L.甲酰胺的添加并不能优化拟穴青蟹ISSR-PCR反应结果,而低浓度的二甲基亚砜可提高扩增产物的清晰度,但与引物相关.     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料,研究了Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶,以及退火温度对RAPD反应的影响,建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系。反应总体积为20μL,Mg2+浓度为2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶浓度为1U,引物浓度为2μmol/L,dNTPs浓度为400μmol/L,模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序:94℃预变性2min→40循环(94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃延伸5min。     

大麻哈鱼SRAP反应体系正交设计及优化

以大麻哈鱼基因组DNA为模板,利用相关序列多态性(SRAP)技术以及L25(56)正交试验和单因子试验方法,分析了不同浓度的TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、Mg2+、DNA模板对扩增结果的影响,最终确立的PCR最佳反应体系为15μl,该体系含有1×PCRbuffer,TaqDNA聚合酶0.75U,引物浓度0.3μmol/L,dNTPs浓度0.3mmol/L,Mg2+浓度2.5mmol/L,DNA模板100ng。利用此优化反应体系,获得了清晰、稳定、多态性高的DNA谱带。     

鳜鱼SSR-PCR反应条件的优化探索

以鳜(Siniperca chuatsi)基因组DNA为试验材料,研究MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶3个反应参数对微卫星PCR的影响,建立一套适合鳜微卫星PCR反应的最佳体系.结果表明,在25μL的反应体系中,Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶3个参数的适宜浓度分别为1.2 mmol/L、0.2 μmol/L和0.04 U/μL.PCR反应程序为94℃变性5 min,94℃30 s,56℃ 1 min,72℃ 1 min,共30个循环,最后72℃延伸5 min.     

西施舌基因组DNA的提取及其RAPD反应条件的优化

通过实验比较获得了一种高效、简便的西施舌基因组DNA的提取方法,以该法提取的基因组DNA为模板,对西施舌RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了研究,初步确定了适于西施舌RAPD分析的最佳反应体系:25μL反应体系中,含模板DNA 25 ng,10×PCR缓冲液2.5μL,dNTPs 0.3 mmol/L,MgCl22.5 mmol/L,引物15 ng,Taq DNA聚合酶1.5U。     

甘肃金鳟RAPD反应体系构建及优化

以甘肃金鳟尾鳍为试验材料,提取基因组DNA。对影响甘肃金鳟RAPD扩增的重要参数进行了优化试验,包括模板DNA浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq酶、变性时间、退火温度等,建立了甘肃金鳟RAPD反应的最适体系。即在25μl反应体系中:模板DNA用量为4.0 ng/μl;Mg2 浓度为2.5mmol/L;dNTP浓度为0.5 mmol/L;引物浓度为0.5μmol/L;Taq酶用量为1 U;扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性45 s,36℃退火50 s,72℃延伸1 min,共35个循环,最后延伸10 min。     

青鱼ISSR-PCR反应体系的建立及优化研究

以赣江野生青鱼(Mylopharyngodon piceus)基因组DNA为试验材料,研究Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和模板浓度4个参数对ISSR-PCR反应的影响,建立一套适合青鱼ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明,在25μL的反应体系中,Mg2+、dNTP、引物和模板4个参数的最适宜浓度分别为:3.0mmol/L、0.25mmol/L、0.4umol/L和30ng。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃30s,52℃45s,72℃2min,共38个循环,最后72℃继续延伸10min。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料，研究了Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶，以厦退火温度对RAPD反应的影响，建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系，反应总体积为20μL。Mg^2＋浓度为2．5μmol／L，TaqDNA聚合酶浓度为1U，引物浓度为2μmol／L，dNTPs浓度为400μmol／L．模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序：94℃预变性2min→40循环（94℃变性1 min→36℃退火1min→72℃延伸lmin）→72℃延伸5min．     

刀鲚RAPD分析条件的优化

以刀鲚基因组DNA为模板,对刀鲚RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度,dNTPs浓度、引物浓度进行了研究。研究结果初步确定了适用于刀鲚遗传多样性分析的RAPD反应体系为:25μl反应体系中,含10×PCR缓冲液2.5μl,模板DNA20ng, dNTPs0.1m mol/L,Mg~(2+)2.5m mol/L,引物0.4μ mol/L,Taq DNA聚合酶1U。     

中国对虾SRAP分子标记体系正交优化及在遗传多样性分析中的应用

利用正交设计L16(45)对影响中国对虾SRAP分子标记分析的5个因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP和引物浓度)在4个水平上进行了优化,筛选出各反应因素的最佳水平为:20μl反应体系中包含1.0UTaq酶,2.0mmol/L的Mg2+,40.0ng的模板DNA,0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物,退火温度为53.5℃。研究表明,各因素的不同水平对扩增结果有显著影响,其中Mg2+影响最大,影响大小顺序依次为Mg2+,Taq酶,引物,dNTP和模板DNA。利用优化的SRAP分子标记体系对中国对虾"黄海1号"第12世代选育群体进行了遗传多样性分析,实验结果表明,此标记技术可作为中国对虾遗传分析的良好技术工具。遗传多样性分析共筛选出8对可以扩增出清晰稳定条带的引物组合,共获得171个位点,其中多态性位点154个,占90.08%;有效等位基因数为1.7741,期望杂合度均值为0.4219,Shannon多样性指数为0.6055。上述参数值均高于应用AFLP技术对前几代选育群体的遗传多样性分析结果。