H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建

经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

一种基于无缝克隆构建重组杆状病毒的方法

一些病毒复制过程涉及到断裂双链DNA的修复,主要有同源重组和非同源的末端连接2种修复形式。基于这种修复机制建立了构建重组杆状病毒的无缝克隆方法,采用该方法构建重组病毒的2个主要元件是:线性化的复制缺陷型杆状病毒载体和重组拯救DNA片段。杆状病毒载体经Bsu36Ⅰ酶切后产生2个末端,即切短了的orf1629 3'末端和细菌人工染色体(BAC)末端。其中,含克隆目的基因的重组拯救DNA片段通过同源臂同源重组修复病毒载体orf1629缺失的3'端序列,并通过细胞内的非同源末端连接修复细菌人工染色体片段(BAC)Kanr末端,从而使载体环化产生重组杆状病毒。应用该方法构建重组杆状病毒无需构建重组载体,无需进行重组后筛选,具有成本低、效率高的特点。     

利用CRISPR/Cas9系统构建绿色荧光转基因斑马鱼

斑马鱼是研究人类疾病的重要动物模型,基因组定点编辑技术在利用斑马鱼研究同源基因功能方面提供了简便高效的途径。利用CRISPR/Cas9系统,在斑马鱼TU品系第5号染色体中选择靶位点,将Cas9 mRNA、靶位点识别的sgRNA和带有同源重组臂、利用短链肌球蛋白(Mylz2)启动子启动的绿色荧光蛋白(eGFP)基因显微注射到斑马鱼受精卵中,获得在该位点定点插入外源基因,并在肌肉中特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼。利用基因组DNA的PCR扩增,结合激发光下斑马鱼胚胎荧光表达情况,在存活的87尾幼鱼中发现其中45尾有荧光表达,同源重组率为51.724%。研究表明,利用CRISPR/Cas9系统成功定点插入外源基因,并获得在肌肉中特异性表达绿色荧光的斑马鱼。     

重组马立克病毒通用转移载体的构建及初步应用

本实验以独立启动子控制的增强型绿色荧光基因(GFP)作为报告基因,同时将CMV启动子及其多克隆位点与之连接,构成外源基因表达盒,插入到马立克病毒(MDV)复制非必需区基因(短独特区US2等)构成的同源臂中,构建成重组马立克病毒的通用载体。鉴定正确后,将转移载体与提取的MDV基因组共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),同源重组获得具有感染性的重组病毒,待病毒蚀斑出现后,荧光显微镜下观察,可见到明显的绿色荧光病毒蚀斑,经三次筛选,初步分离到重组病毒。结果表明,转移载体与MDV基因组共转染可获得感染性病毒,US2基因可作为重组病毒构建中的外源基因插入位点,证实通用转移载体的构建是可行的,为重组马立克病毒新型疫苗的研究奠定物质基础。     

表达绿色荧光蛋白的MVA重组毒株的构建及筛选

为了构建及筛选表达绿色荧光蛋白（GFP）的改良型痘苗病毒安卡拉（MVA）重组毒株,并对其进行鉴定,本研究基于同源重组原理设计引物,通过PCR扩增获取含有MVA两侧同源臂的外源基因GFP片段,将GFP基因片段转染到感染了MVA的CEF细胞中使之同源重组到MVA ORF086-087位点（基因组中70303-70304 bp之间）,利用倒置荧光显微镜观察并标记表达GFP的单个噬斑,筛选获取重组毒株,应用倒置荧光技术、PCR及Western blotting对该重组毒株进行鉴定。结果显示,经过3轮噬斑筛选,在倒置荧光显微镜下可观察到大量表达GFP的单个噬斑,PCR扩增检测结果表明目的基因已成功整合到重组毒株MVA-GFP中。Western blotting结果表明,GFP在感染的细胞内成功表达。本研究利用基因工程技术成功获得表达GFP的重组毒株MVA-GFP,可为进一步将其他抗原基因插入GFP位点中筛选无标记的重组毒株及疫苗研究提供材料。     

带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究

本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII.将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC.通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度.重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传.本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础.     

禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。     

鸭瘟病毒TK基因缺失转移表达载体的构建

根据Gen Bank发表的鸭瘟病毒基因组序列设计1对引物,扩增出含完整TK基因及其上下游序列的长约2.0 kb片段。利用该片段5'端和3'端部分序列作为左右同源臂,其内构建有Pcmv-MCS-BGH pA及同向Psv40-lac Z-SV40 pA表达盒,同时在lacZ基因表达盒两侧设计有loxP序列,从而获得鸭瘟病毒TK基因缺失转移表达载体p DTK-lacZ。将p DTK-lacZ转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,原位染色后镜下可见多处着染蓝色的细胞,结果表明本试验构建出适用于重组鸭瘟病毒制备平台的转移表达载体。     

鲤鱼春季病毒出血症病毒G基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

采用RT-PCR方法扩增鲤鱼春季病毒出血症病毒（SVCV）的糖蛋白（G）基因,将PCR产物插入到杆状病毒转移载体pFastBac 1中,获得重组转移载体pFastBac 1-G,将其转化入含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含有G基因的重组穿梭质粒rBacmid-G。在脂质体转染试剂的介导下,将rBacmid-G转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。提取重组杆状病毒基因组,用M13引物PCR鉴定。对重组杆状病毒感染的sf9细胞,通过电镜观察、SDS-PAGE、Western blotting进行检测,结果表明,重组蛋白在sf9细胞中获得正确表达,相对分子质量约58 000,与鼠抗SVCV阳性血清具有良好的反应原性。本试验为研究鲤鱼春季病毒出血症病毒G蛋白的生物学活性和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白的MVA重组毒株的构建及筛选

为了构建及筛选表达绿色荧光蛋白(GFP)的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)重组毒株,并对其进行鉴定,本研究基于同源重组原理设计引物,通过PCR扩增获取含有MVA两侧同源臂的外源基因GFP片段,将GFP基因片段转染到感染了MVA的CEF细胞中使之同源重组到MVA ORF086-087位点(基因组中70303-70304 bp之间),利用倒置荧光显微镜观察并标记表达GFP的单个噬斑,筛选获取重组毒株,应用倒置荧光技术、PCR及Western blotting对该重组毒株进行鉴定。结果显示,经过3轮噬斑筛选,在倒置荧光显微镜下可观察到大量表达GFP的单个噬斑,PCR扩增检测结果表明目的基因已成功整合到重组毒株MVA-GFP中。Western blotting结果表明,GFP在感染的细胞内成功表达。本研究利用基因工程技术成功获得表达GFP的重组毒株MVA-GFP,可为进一步将其他抗原基因插入GFP位点中筛选无标记的重组毒株及疫苗研究提供材料。     

表达口蹄疫病毒3AB基因的伪狂犬病毒载体的构建

为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。     

表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP.通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5.WA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达.该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础.     

利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统

为了较好地解决家蚕杆状病毒基因表达系统(BmNPV expression system)在重组病毒构建和纯化过程中存在的重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长等缺点,借鉴国外AcNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,对家蚕BmNPV基因组进行了改造。通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacm id;并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子以及细菌转座子的基因定位转移作用,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmN-PV病毒的构建。     

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.     

重组杆状病毒表达鸭圆环病毒Cap蛋白及活性检测

为了获得具有活性的鸭圆环病毒Cap蛋白,笔者通过PCR方法获得鸭圆环病毒I型完整Cap基因片段,将其克隆到昆虫杆状病毒基因组中,获得重组杆状病毒qBac-P-Cap,其病毒效价TCID_(50)可以达到9.25。重组杆状病毒可在悬浮Sf9细胞中表达具有活性的鸭圆环病毒Cap蛋白。研究表明蛋白表达最佳收获时间为120 h,纯化后蛋白表达量可以达到200μg/mL。这为进一步研究Cap蛋白功能和大规模制备鸭圆环疫苗奠定了基础。     

口蹄疫多基因杆状病毒转移载体的构建

采用分步 PCR扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因 P1 ,非结构蛋白基因 2 A、2 B、3 C蛋白酶和 3 D聚合酶按正确的读码框依次连接克隆入 p GEM-T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入杆状病毒转移载体 p Mel Bac B。构建成功的重组 p Mel Bac B/P1 2 X3 C3 D转移载体经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,转移载体可与杆状病毒骨架载体进行昆虫 sf9细胞内同源重组 ,以产生重组杆状病毒     

猪传染性胃肠炎病毒S基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）全长S基因插入pAdTrack—CMV穿梭质粒中，形成的转移质粒pAdTrack—CMV／S线性化后，用pAdEasy^TM系统电转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠埃希氏菌BJ5183，经同源重组，构建了含有全S基因的重组腺病毒载体，经酶切充分暴露反向末端重复序列后，与脂质体混合转染AD-293细胞，成功获得了AD-S复制缺陷型腺病毒，经检测证实，AD-S稳定性好，安全性高。转录水平检测证实，S基因得到了转录；荧光检测发现，外源蛋白已得到表达。