禽坦布苏病毒包膜蛋白E的基因特征

为明确禽坦布苏病毒包膜蛋白E的基因特征,运用RT-PCR从已经分离鉴定的禽坦布苏病毒中扩增出其包膜蛋白E全基因,并进行克隆测序和分析。结果表明,禽坦布苏病毒包膜蛋白E全长为1503bp,编码501个氨基酸。所编码的包膜蛋白E大小为54.217ku,理论等电点为6.89,不稳定系数为25.48,属于稳定蛋白质类。利用TMHMM2.0进行跨膜区分析发现,该蛋白的拓扑结构为o442-464i471-489o。本试验株包膜蛋白E和北京鸭源坦布苏病毒（GenBank号：JF459991）同源性最高,达99.8％,和雌麻鸭源坦布苏病毒（GenBank号：JQ928189）核苷酸同源性最低,为98.2％,不同来源（鸡源、鸭源、鹅源、鸽源和蚊子源）坦布苏病毒包膜蛋白E同源性均较高,没有表现出宿主特异性。     

禽坦布苏病毒NS1-ELISA的初步建立

对禽坦布苏病毒非结构蛋白NS1基因进行原核表达,并进行生物学活性鉴定。将表达成功具有生物学活性的重组蛋白经纯化后,作为抗原包被ELISA平板,通过条件优化,建立检测禽坦布苏病毒血清学检测方法。结果表明,表达的NS1重组蛋白大小约为60kd,该蛋白经Western blot检测具有良好的生物学活性。将该重组蛋白纯化后包被ELISA板建立检测禽坦布苏病毒血清学间接ELISA方法,该方法优化后的参数为2.5μg·mL~(-1)包被ELISA板;一抗(鸭血清)血清稀释度为1∶100;酶标二抗为1∶3 000。本研究建立的方法特异性强,批内和批间重复性较好。用建立的间接ELISA方法对坦布苏病毒灭活苗免疫鸭血清和自然感染鸭血清进行检测,结果表明,本研究建立的NS1-ELISA不能用于区分禽坦布苏自然感染和疫苗免疫血清的鉴别诊断。     

我国部分地区鸡感染禽坦布苏病毒血清流行病学调查

为了解鸡群感染禽坦布苏病毒的情况,应用已建立的间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA ）对2010年12月至2013年9月近3年内采自福建、江西、浙江、广东4省发生产蛋异常鸡场的开产海兰蛋鸡、后备海兰蛋鸡2300份血清样品进行禽坦布苏病毒抗体的检测。结果显示,开产蛋鸡血清样品的禽坦布苏病毒抗体阳性率为43.4％,而后备蛋鸡为19.9％;在开产蛋鸡中,以福建省的阳性率最高,为60.7％,而在后备蛋鸡中则以广东省最高,为37.2％。4省采集的蛋鸡血清样品中均检出禽坦布苏病毒抗体,且开产蛋鸡的阳性率高于后备蛋鸡,揭示福建、江西、浙江、广东4省海兰蛋鸡在不同程度上感染禽坦布苏病毒,研究结果可为以上地区乃至我国鸡群做好禽坦布苏病毒感染的预防提供依据。     

禽坦布苏病毒连接酶依赖RT-PCR检测方法的建立及应用

根据连接酶依赖PCR工作原理设计并建立一种禽坦布苏病毒RT-PCR快速检测方法。结果显示,该方法能特异性检测不同禽源的坦布苏病毒分离株,且与常规RT-PCR检测敏感性相当。运用该方法对动物攻毒试验采集的6份样品及2011~2012年间采集自福建、江西、浙江及广东省发病鸭场的140份样品进行检测。动物试验样品均为阳性,临床样品检出率为14.3%(20/140)。试验结果表明,本试验所建立的连接酶依赖RT-PCR方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于禽坦布苏病毒的流行病学调查及病毒检测。     

鸭坦布苏病毒E蛋白包被抗原间接ELISA方法的建立

以鸭坦布苏病毒E蛋白的主要优势抗原表位区E1蛋白作为包被抗原,建立检测鸭坦布苏病毒中和抗体效价的间接ELISA方法。优化后确定最佳的抗原包被浓度为1.548mg·L-1,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶6 000。特异性表明,用建立的ELISA方法对禽流感、新城疫病毒、1型鸭肝炎病毒、胰腺型鸭甲肝病毒、禽霍乱和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清进行检测,均未发生交叉反应;批内和批间重复试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶3 200。该方法与以全病毒为包被抗原的间接ELISA检测结果相关性达到95.1%。利用该方法对237份来自福建省开产麻鸭的血清样品进行检测表明,其血清阳性率达77.9%,表明福建省开产麻鸭感染鸭坦布苏病毒阳性率很高。本试验建立的间接ELISA检测方法具有特异性强,重复性好,敏感性高,为鸭坦布苏病毒抗体检测提供了简单快捷的检测方法。     

种番鸭源禽坦布苏病毒分离鉴定及基因组序列分析

种番鸭是否感染禽坦布苏病毒颇受国内学者关注。本研究于国内外首次自表现产蛋下降的种番鸭卵巢中分离获得1株病毒（命名为WYZLJ-1359株）,经RT-PCR方法鉴定为禽坦布苏病毒。经比较分析该病毒与我国其他禽源分离株全基因组序列表明,种番鸭源分离株WYZLJ-1359主要分子特征未出现变异,与2010年以来我国分离的其他禽源分离毒株的核苷酸序列同源性均在98.4％以上,且亲缘关系非常近,遗传距离均在1.8％以下,远低于与2000年以前分离的坦布苏病毒分离株之间的遗传距离。以上结果表明,我国禽坦布苏病毒感染的宿主在不断增加,但病毒在不同品种家禽的传播过程中遗传较为稳定,基因组未出现基因的缺失或插入等变异现象。     

鹅源坦布苏病毒SHYG株的分离与鉴定

【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增生。【结论】坦布苏病毒SHYG株对雏鹅有较强的致病性。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。     

坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白免疫保护效果

为了探讨原核表达的坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白对于坦布苏病毒感染的免疫保护作用,利用IPTG诱导重组大肠杆菌表达坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白,Anti-FLAG M2 Affinity Gel纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白仅有单一目的条带。免疫组小鼠血清ELISA效价均达4.67±0.11(lg10)。攻毒保护试验结果表明,免疫组小鼠体质量在攻毒9 d后高于对照组,荧光定量RT-PCR检测结果显示,攻毒后免疫组小鼠脑、肝脏、脾脏组织中坦布苏病毒核酸含量均低于对照组。表明使用原核表达的坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白免疫可诱导产生高水平抗体,并提供良好的免疫保护力,为开发有效的坦布苏病毒亚单位疫苗提供依据。     

鹅源坦布苏病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

坦布苏病毒是新发现的一种可引起家禽产蛋和采食量下降及死亡的黄病毒属病毒。根据GenBank中登录的鹅源坦布苏病毒NS5基因序列,利用Primer Explorer V4软件在序列保守区域设计1套特异识别NS5基因序列中6个不同区段的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,并以此套引物建立一种基于LAMP技术的鹅源坦布苏病毒检测方法。结果表明,该方法灵敏度极高,是普通PCR方法的100倍,只能特异性扩增坦布苏病毒的RNA,对于其他常见禽RNA病毒均无特异性扩增。在反应体系中加入SYBR GreenⅠ染料后,通过肉眼观察有无绿色荧光可直接判定结果。该方法特异性强,灵敏度高,无需特殊仪器,简便,快速,适用于鹅源坦布苏病毒的临床快速检测。     

白羽半番肉鸭坦布苏病毒的分离鉴定及结构蛋白基因分析

自肝脏表现不规则出血的白羽半番肉鸭脏器中分离获得1株病毒(命名为ZZ40株),经(RT-)PCR检测为鸭坦布苏病毒,可被鸭坦布苏病毒高免阳性血清特异性中和。应用鸭坦布苏病毒特异性引物从该株病毒基因组中成功获得结构蛋白基因片段,该片段与近年来我国分离的禽源坦布苏病毒株核酸序列同源性均在99.1%以上,而与蚊媒源坦布苏病毒MM-1775株同源性仅为88.6%;分子进化分析表明该株病毒与BYD-1等近年来的鸭坦布苏病毒分离株共处于一个进化分支。以上结果表明,我国白羽半番肉鸭存在坦布苏病毒感染,且该分离毒株的抗原性与我国早期分离于种(蛋)鸭的坦布苏病毒差异不明显。     

鹅坦布苏病毒囊膜蛋白结构域Ⅱ在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

为了实现鹅坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)结构域Ⅱ在大肠杆菌中的表达并对其进行免疫学鉴定,根据鹅坦布苏病毒JS804株囊膜蛋白基因序列,利用人工合成法获得鹅坦布苏病毒囊膜蛋白结构域Ⅱ编码基因并引入限制性酶切位点,片段大小为507 bp。将合成的基因片段克隆入pGEX-4t-1原核表达载体中,构建重组表达载体pGEX-EII并转化至BL21(DE3)中。通过优化表达条件获得重组蛋白质并进行免疫学鉴定。结果显示,重组蛋白质分子量约为4.4×104,Western-blot和间接免疫荧光检测结果表明重组蛋白质具有良好的免疫原性。     

抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的PET28a-NS5载体转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用纯化的鸭坦布苏病毒NS5蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗,并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得2株稳定分泌针对DTMUV的NS5蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为A4D1和B4B8。此2株杂交瘤细胞诱导BALB/c小鼠的抗体效价均可达到1∶64 000。间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,所获细胞分泌的抗体能与DTMUV及纯化的NS5蛋白发生特异性反应。经鉴定2株单抗的亚类均为IgG1型,通过叠加ELISA方法,初步判定2株单抗识别不同的抗原表位。【结论】成功获得了抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为研究NS5蛋白的功能奠定了基础。     

安徽农业大学王桂军教授课题组首次在我国鹅群中发现新型鸭坦布苏病毒变异株

正鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV)自2010年在我国首次报道以来,已迅速传遍我国各大水禽养殖地区,给水禽养殖业带来重大经济损失。鸭坦布苏病毒在多年来不断发生变异,给防治带来困难。近日,安徽农业大学王桂军教授课题组一项研究发现一种新型的强毒力鸭坦布苏病毒在我国出现,并首次在雏鹅中传播。王桂军教授课题组在临床研究中发现感染鸭坦布苏病毒的鹅群表现出明显的神经症状。     

鸭巴泰病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)的快速检测方法,本研究基于该病毒囊膜蛋白(M)基因序列的保守区域,经优化反应条件,对检测方法的特异性、敏感性及重复性进行了测定,建立了一种用于检测BATV的一步法RT-PCR快速诊断方法。所建立的检测方法可特异性扩增出BATV M基因480bp的序列片段,其最低检测病毒量为1×10~(1.1) TCID_(50),且重复性好,对禽坦布苏病毒、鸭甲肝病毒等5种鸭常见传染病病原均未扩增出相应的片段,特异性好。以上结果表明,所建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性和敏感性,可用于鸭BATV感染的早期快速诊断及流行病学调查。     

鸡源坦布苏病毒（SN01株）的分离与鉴定

采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞, 并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性, 序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒（SN01）可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。     

禽坦布苏病毒NS1基因的原核表达

根据GenBank中登录的禽坦布苏病毒(avian Tembusu virus,ATMV)WR株非结构蛋白NS1基因设计特异性引物,采用RT-PCR方法从禽坦布苏病毒WR株核酸中扩增其NS1基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上构建原核表达重组质粒pGEX4T-NS1,进行条件优化诱导表达,将表达的目的蛋白经SDSPAGE分析。结果表明,分子量约为62kD的重组目的蛋白得到表达。     

蛋鸭主要病毒病感染检测与分析

为明确引起蛋鸭产蛋下降的病毒病,自2011年来以建立的(RT-)PCR方法对我国部分省(区)临床调查采集和送检的表现产蛋下降蛋鸭样品进行禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、禽1型副粘病毒和鸭瘟病毒检测,结果感染阳性率分别为25.1%(212/843)、27.7%(298/1076)、9.3%(46/495)和1.3%(8/614),其中鸭坦布苏病毒病和禽流感是危害我国蛋鸭养殖业的主要疫病;经对549份后备未开产蛋鸭组织样品进行鸭坦布苏病毒感染检测发现其阳性率为40.8%,按年份统计以2015年的阳性感染率最高达70.5%。以上检测结果揭示随着时间的推移,鸭坦布苏病毒不仅严重危害我国开产蛋鸭群导致产蛋量急剧下降,还严重危害后备未开产蛋鸭群,表现迟开产、产蛋率不稳定、产蛋率持续走低或产蛋高峰维持时间短等多种产蛋异常现象,表明我国蛋鸭群存在严重的坦布苏病毒早期感染问题,应引起我国蛋鸭养殖者和有关部门的高度重视。     

鸭坦布苏病毒E基因的克隆表达及初步应用

利用PCR方法从鸭坦布苏病毒山东分离株(BZ株)扩增整个E基因,全长1 503 bp,克隆到pMD18-T载体中,然后将双酶切目的片段亚克隆入pET-28a(+)载体,构建出重组表达质粒PET28a-E。将PET28a-E转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导可表达出分子量约54.8 kD的蛋白,Western blotting试验呈阳性,表明E蛋白有很好的反应原性。以纯化的表达产物作为包被抗原,鸭坦布苏病毒血清为一抗,HRP标记的羊抗鸭IgG为二抗建立间接ELISA方法。采用该方法对80份送检鸭血清进行检测,并与中和试验进行比较,结果显示,两者的符合率为95.0%,表明该方法具有较好的应用前景。     

鸭坦布苏病毒囊膜 E蛋白的原核表达

利用 RT-PCR 方法扩增鸭坦布苏病毒分离株（WR 株）全长 E 蛋白基因,克隆到 pEASY-T3载体中,经Bam HI和XhoI酶切后将目的片段连接入pET-32a载体,构建原核表达重组质粒pET-E。表达质粒转化入感受态细胞 BL21（DE3）后,经IPTG 诱导后表达出鸭坦布苏病毒 E 蛋白,并以包涵体的形式存在,Western-blotting试验呈阳性,表明 E蛋白有很好的反应原性。