坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。     

一株鹅源巴氏杆菌强毒株的分离及鉴定

为了确定导致山东某鹅场种鹅发病的病原.从病死鹅肝脏、心脏中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化鉴定、PCR和致病性试验等进行鉴定.致病性试验结果表明,1.2×109 CFU/mL的菌液10倍系列稀释后,接种11日龄健康雏鸭后,该分离菌株对11日龄健康雏鸭的LD50为10-4.5 CFU/mL.死亡雏鸭的剖检病变与病死鹅类似,并分离出形态特征完全一致的菌落.病理组织学变化以十二指肠绒毛断裂、脱落、肝细胞脂肪变性、心肌纤维断裂为特征.药敏试验结果显示,该分离菌株对头孢曲松钠、阿莫西林、氨苄西林、氧氟沙星等较敏感.山东某鹅场中发病病原经分离鉴定为多杀性巴氏杆菌,为禽巴氏杆菌病的诊断与防治提供了科学的依据.     

鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

鸭坦布苏病毒山东株的分离鉴定及其特性

采用鸭胚尿囊腔接种、盲传的方法从山东某地区以瘫痪为主要特征的雏鸭脑组织中分离到1株病毒,并对分离病毒的生物学特性和理化特性进行了研究。结果显示,该病毒与OenBank上已发表的坦布苏病毒核苷酸同源性均高于98％,最高可达99．7％;病毒的ELD50为10^-3.17／0．2mL,接种9日龄鸭胚,68h左右鸭胚死亡,胚体出血,肝脏肿大出血,尿囊膜增厚;病毒对胰蛋白酶、酸、氯仿和热敏感,0．5％的胰蛋白酶、pH〈5和4．8％的氯仿条件下可将其灭活,56℃水浴20min或60℃水浴15min可将其灭活,37℃处理24h毒力由10^-3.17／0．2mL下降至10^-1.8／0．2mL;Mg2＋不能提高病毒在50℃60min的稳定性;病毒未经酸碱处理不具有凝集鸡、鸭、鸽等红细胞的特性。接种7日龄雏鸭,48h后陆续发病,表现为病毒性脑炎;剖检变化为雏鸭脑水肿,脑部毛细血管充血、肝脏出血、腺胃出血、肺出血水肿,临床表现与自然发病相同。结果表明,该病毒分离株为坦布苏病毒。     

鸭出血性卵巢炎的初步研究

2010年6月以来,我国部分地区所饲养的种鸭和蛋鸭发生一种疾病,以突发产蛋急剧下降为特点,根据病变,暂将该病称为鸭出血性卵巢炎(duck hemorrhagic ovaritis,DHO)。从不同地区的发病鸭群采集34份样品,取15份样品进行病毒分离,获得10个鸡胚分离物和5个鸭胚分离物。RT-PCR检测结果表明,15个分离物均为禽流感阴性,14个分离物为新城疫阴性。选分离株YY5株进行了电镜观察和PCR排查,结果表明,该毒株的毒粒直径为40~50 nm,呈鸭瘟病毒、水禽细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭圆环病毒、鸭冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒PCR阴性,但为黄病毒RT-PCR阳性。基于黄病毒NS1序列合成引物,用RT-PCR检测15株病毒分离物和其余19份临床样品,黄病毒阳性率为82.4%。用YY5株的221-nt NS1序列进行分析的结果显示,YY5株与黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)的巴格扎病毒(Bagaza virus)具有相近的遗传进化关系,但遗传距离介于病毒种的水平。用一株鸭胚分离株感染91日龄临近开产的麻鸭和232日龄的产蛋麻鸭,可复制出卵泡膜出血的病变。结果表明,从DHO自然病例分离到一种新的黄病毒,暂称为鸭黄病毒(duck flavivirus,DFV),DFV可能与DHO有关。     

探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用

利用RT-PCR方法扩增鸭黄病毒的NS3基因406bp的特异性片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备核酸探针。特异性试验结果表明,该探针仅与鸭黄病毒的核酸特异性杂交,而与鸭瘟病毒、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的核酸杂交均为阴性。敏感性试验表明,该探针对鸭黄病毒的RNA最低检出限量为100μg/L。对疑似黄病毒感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测,以卵泡膜的检出率最高。该研究为鸭黄病毒感染的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。     

2017年山东16株H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及其HA基因序列分析

为了解山东省H9N2亚型禽流感的流行情况, 2017年从山东省不同地区分离并鉴定16株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)株,并对其血凝素(HA)基因进行扩增、克隆和测序,将所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,2017年分离的16株病毒之间HA基因的核苷酸序列同源性为91.2%~99.8%,氨基酸同源性为93.6%~100.0%。系统进化树显示,16株病毒均属于H9.4.2.5分支,表明H9.4.2.5分支毒株仍是山东省H9N2亚型AIV主要流行株。重要氨基酸位点研究显示,16株病毒的HA蛋白的裂解位点仍是K/RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的特征;16株病毒的234受体结合位点多为L,除198位受体结合位点存在变异外,其他受体结合位点均保守;16株病毒的潜在糖基化位点有7个~8个,其中7个位点较保守,而218位糖基化位点均缺失,其中3株病毒分别在145位、206位和285位新增糖基化位点。总之,山东省分离的H9N2亚型AIV在分子生物学上发生了部分新的遗传进化,但与临床上病毒的致病性与流行规律的关系还有待于进一步研究。