禽传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体制备及其中和抗原表位的鉴定

为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位，本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠，经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为10⁶以上，Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株，同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测，发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后，在抗原表位和Western blot分析的基础上，鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域，获得了6个中和抗原表位，其中除⁴¹⁶IQTRTEP⁴²²表位，其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体，不仅丰富了IBV的单克隆抗体库，为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料...     

鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株S蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达及其免疫原性

为了对鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)广西优势血清型代表株GX-YL5的S蛋白进行真核表达并研究其免疫原性,设计GX-YL5毒株S基因特异引物,扩增出目的片段后,构建重组表达载体pFastBacTM/HBM-TOPO-S,转化DH10Bac细胞获得重组杆状病毒rHBM-S;重组S蛋白鉴定正确后,大量表达、纯化并免疫新西兰大白兔制备兔抗血清,应用IFA、Western blot以及间接ELISA、气管环(TOC)中和试验对该重组蛋白的反应原性及免疫原性进行分析。结果显示,成功获得重组S蛋白;制备的抗S蛋白多抗血清具有良好的特异性,ELISA效价可达1∶25600,TOC中和试验滴度为1∶512。结果表明,应用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了具有很好免疫原性的GX-YL5株的S蛋白。本试验为研究IBV S蛋白的生物学功能、研发诊断试剂和制备新型疫苗等奠定了基础,为利用昆虫杆状病毒表达系统进行IBV或其他冠状病毒结构蛋白的表达及多抗的制备提供了借鉴和参考。     

广西优势血清西优势血清型IBV代表株M基因在杆状病毒系统中的表达

采用RT-PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西优势血清型代表性毒株GX-YL5的膜(M)蛋白基因,将其克隆至pFastBac~(TM)/HBM-TOPO杆状病毒转移载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rHBM-M;将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒;利用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)鉴定表达的M蛋白。IFA检测可见重组杆状病毒感染后72h细胞出现特异性荧光,Westernblot检测可见大小约为26ku的特异性蛋白带,表明该重组M蛋白在Sf9昆虫细胞中成功获得表达。研究为IBVM蛋白的生物学功能、IBV诊断试剂和新型疫苗制备等奠定基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因抗原区的原核表达及鉴定

本研究以鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1基因为研究对象,设计特异性引物扩增S1抗原集中区目的基因,长度为198 bp,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-S1,转化至宿主菌Rosetta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,表达获得1条特异性蛋白条带,其分子质量大小为33.0 ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以包涵体形式存在。Western blotting结果显示,重组蛋白能与IBV鸡阳性高免血清反应,被GST标签单抗识别,结果表明该融合蛋白正确表达并具有良好的抗原性。本研究为制备IBV单克隆抗体奠定了抗原基础。     

鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

为了制备鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体,研究利用纯化的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)tl/CH/LDT3/03免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了1株能稳定分泌抗IBVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3G11,并进行了ELISA检测。结果表明:该杂交瘤细胞诱生小鼠腹水效价为1∶25 600;McAb3G11重链亚类属于IgG2b,轻链为κ链;McAb3G11不仅能识别原核表达的M蛋白,而且还能够识别天然的IBVM蛋白。McAb3G11针对的表位位于M蛋白的99~172 aa之间,并且其在不同IBV毒株间保守。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank已公布的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,设计1对IBV S1基因表达片段的PCR引物,用RT-PCR方法扩增出长度为1 566 bp IBV S1基因表达片段,5′端不含信号肽序列,3′端添加了终止密码子。用限制性内切酶SnaB和Not将S1基因和载体pPIC9K酶切回收后连接,构建了重组表达载体pPIC9K-S1。用限制性内切酶Bgl将表达质粒pPIC9K-S1线性化,然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115,在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定和表型筛选后,获得了整合型阳性重组菌株GS115/pPIC9K-S1 His Muts。将重组菌株在1%甲醇中进行诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,IBV S1基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的分子量约为76 000,能与IBV阳性血清特异性结合,表达的蛋白占上清中总蛋白量的12.5%。     

禽传染性支气管炎病毒S2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备禽传染性支气管炎病毒(IBV) S2蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过原核表达系统表达并纯化重组S2蛋白，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到4株能够稳定分泌S2蛋白MAb的杂交瘤细胞株，分别命名为1A7、4F12、4A7、4D1。亚类鉴定结果显示4株MAb的重链均为Ig G1，轻链均为κ。采用间接ELISA法检测上清及腹水效价，结果显示MAb细胞上清效价均不低于1∶12 800，腹水效价均不低于1∶51 200。采用western blot检测制备的S2蛋白MAb与IBV感染鸡胚尿囊液后天然表达的S2蛋白的反应原性；采用间接免疫荧光试验(IFA)检测IBV感染非洲绿猴肾细胞(Vero)后天然表达的S2蛋白的反应原性。Western blot结果显示，感染IBV的鸡胚尿囊液中出现了90 ku左右的特异性条带；IFA结果显示，感染IBV的Vero细胞中出现绿色荧光。以上结果表明，制备的S2蛋白MAb能够与天然表达的S2蛋白反应，反应原性较强。利用间接ELISA检测MAb与S2蛋白的亲和力，结果显示4株MAb对S2蛋白均有良好的亲和力。利用一系列表达部分重叠的重...     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

免疫鸡群IBV的分离鉴定及其S1基因序列研究

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)变异情况,对2018—2019年多次发生疑似鸡传染性支气管炎(IB)的广西某公司发病鸡群进行IBV的分离鉴定,并对分离株进行S1基因序列测定、同源性、系统进化树和重组分析。结果显示:共分离到5株IBV,其S1基因核苷酸相似性为85.2%～99.9%;5株IBV中3株S蛋白裂解位点为HRRRR,2株为RRFRR;2018年分离的2株IBV属于LX4型中的QXⅡ亚型,与疫苗株QXL87处于同一个分支;2019年分离的3株IBV为LDT3-A型,且均为重组毒株,来源于分离株GX-YL161022(QXⅡ亚型,主亲本)与参考株CK/CH/LSC/99I(次亲本)的重组。研究表明这5株IBV主要为LX4型毒株及其参与的重组株,未及时免疫与流行株基因型相同的疫苗以及重组导致的变异可能是造成该养殖场免疫失败的主要原因。     

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp5在真核细胞中的重组表达及鉴定

本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,获得nsp5重组杆状病毒,经(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot检测到转染细胞表达的nsp5蛋白。进一步从感染的细胞中纯化重组蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠制备了抗nsp5的多抗血清,该多抗血清可检测到IBV四川株SC021202感染的DF-1细胞中特异性的nsp5蛋白。结果表明IBV nsp5在Bac-to-Bac真核表达系统中获得了成功表达,而且具有良好的免疫原性和反应原性。     

含鸡源启动子的真核表达载体的构建及IBV S1蛋白抗原表位的表达

利用PCR方法扩增出鸡β-肌动蛋白(β-actin)启动子基因序列,克隆至pcDNA3.1和pCIneo载体中以替代CMV启动子,获得含鸡源启动子的真核表达载体pcDNA-act和pCIneo-act。将IBV ZY3S1蛋白抗原表位基因亚克隆到启动子替换前后的质粒中,然后将重组质粒转染至鸡胚成纤维细胞(CEF)中,采用间接免疫荧光试验检测转染细胞对S1蛋白抗原表位的表达。将重组质粒以150μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,同时设立IBV灭活疫苗组及PBS空白对照组,经间接ELISA检测免疫前后血清中IBV特异性抗体,最后使用ZY3强毒株给各组实验动物攻毒,观察鸡群的发病死亡情况,计算攻毒保护率。结果显示,替换启动子后的表达载体在CEF中对S1蛋白抗原表位的表达量以及实验动物的抗IBV抗体水平均高于未更换启动子的相应载体,攻毒后鸡群的发病率和死亡率均比替换前降低,说明外源基因的表达和启动子的来源有密切的关系。     

鸡传染性支气管炎病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

为获得鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)N蛋白的单克隆抗体,通过原核表达IBV N蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株,命名为1#、18#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的3株单克隆抗体亚型均为IgG1,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与IBV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。本研究成功制备了IBV单克隆抗体,为进一步建立IBV检测方法和深入研究IBV的生物学特性奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒QX基因型S1蛋白重组乳酸菌的构建及小鼠免疫应答

为探究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白重组乳酸菌对小鼠免疫应答情况,本研究将IBV CH/LN/2019毒株的S1基因进行密码子优化,构建重组质粒pNZ8149-S1,电转至乳酸乳球菌NZ3900中,应用Western blot及间接免疫荧光试验评价重组乳酸乳球菌表达水平,免疫SPF小鼠,通过间接ELISA方法分析小鼠特异性抗体、CD4⁺、CD8⁺和细胞因子(IL-4和IFN-γ)分泌情况;结果显示,成功构建重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900并表达目的蛋白;小鼠免疫试验结果显示,免疫组小鼠IgG抗体水平均高于pNZ8149/NZ3900、NZ3900和PBS组(P<0.05);特异性sIgA抗体水平显著高于对照组(P<0.01);此外,重组乳酸乳球菌能诱导小鼠产生较高水平的IL-4和IFN-γ(P<0.05)。结果表明,重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900可以有效刺激小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫,为IBV新型口服疫苗的研制提供了理论参考。     

鸡传染性支气管炎病毒SD03株N基因的克隆、序列分析及N蛋白理化性质分析

试验旨在确定国内鸡肾型传染性支气管炎病毒(IBV)流行毒株核蛋白N与市场上现用疫苗株、近年国内外分离株的差异性.本研究利用自山东某鸡场病鸡肾脏组织分离获得、经PCR鉴定为IBV阳性的毒株(命名为SD03株),参考NCBI上部分IBV毒株N基因的保守区域设计引物,进行RT-PCR扩增,构建重组pMD18-T-N/DH5α菌,测序获得N基因序列.与参考株进行了核苷酸及氨基酸同源性分析,结合DNAStar软件与http://www.expasy.org/网站对该基因编码的蛋白进行理化性质分析.结果显示,SD03株为IBV肾型毒株,与LDT3、partridge/GD/S14/2003毒株(肾型)核苷酸及氨基酸同源性均在99.0%以上.与其他国内外肾型经典毒株Ma5、W93、Gray、Holte株氨基酸同源性为90.0%～94.6%,与国内外呼吸型疫苗株H120、H52、M41氨基酸同源性为89.7%～91.0%.本研究深入分析了当前流行株SD03株N蛋白的理化特性,为N蛋白亚单位疫苗在不同系统中表达及蛋白纯化提供了理论依据,为中国现阶段IBV的防控奠定了一定的理论基础.     

鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞表位的鉴定

为鉴定传染性支气管炎病毒(IBV)B细胞抗原表位,本研究将IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ病毒与重组N蛋白作为免疫原,交叉免疫BALB/c小鼠,制备了1株抗IBV N蛋白的单克隆抗体(MAb)6D10。Westernblot结果表明该MAb可特异性的识别IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株和重组N蛋白。同时利用噬菌体展示技术对IBV N蛋白抗原表位进行筛选,获得11个阳性噬菌体克隆。序列分析表明,这11个克隆均展示有"FGPRTK"6个氨基酸的序列,对应于IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株N蛋白242位～247位氨基酸残基。同时,通过人工合成其编码序列并进行原核表达,利用MAb6D10对表达产物进行western blot分析,反应性良好。由此表明"FGPRTK"6肽为IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株的一个线性B细胞抗原表位。表位的保守性分析结果表明,本研究鉴定的表位在各种血清型IBV毒株中均高度保守。本研究结果为进一步研究IBV N蛋白抗原的结构和功能及诊断试剂的研发奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒Holte株S1基因在昆虫杆状病毒系统的表达及其抗原性分析

为真核表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白并鉴定其抗原性,本研究采用RT-PCR方法扩增出IBV Holte株S1基因,并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pFastBacHT中,通过大肠杆茵中同源重组构建重组杆粒Bacmid-S1,将重组杆粒转染至Sf9细胞中,获得含S1基因的重组杆状病毒.将该重组杆状病毒感染Sf9细胞进行表达,经间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明:IBV Holte株的S1蛋白能够在Sf9中以可溶形式表达,蛋白大小约为64 ku,该蛋白具有天然蛋白的抗原性.本研究为生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础.     

猪链球菌7型强弱毒株SBP_bac_5差异表达蛋白的鉴定

前期研究表明细菌胞外溶质结合蛋白家族5 (SBP_ bac_5)基因在猪链球菌7型(S.suis 7)型强毒株WC0711中表达量高于弱毒株M13中,推测SBP_ bac_5为S.suis7型强弱毒株差异性表达蛋白.为进一步证实该结果,本研究采用real-time RT-PCR技术在基因水平检测S.suis7型强弱毒株中SBP bac_5 mRNA的表达量差异,结果显示,强毒株WC0711中SBP bac 5的mRNA表达量为在弱毒株M13中的4.59倍.将SBP bac 5的PCR产物克隆于pET-30a中,通过E.coli BL21诱导表达,纯化后的蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清检测S.suis强弱病毒株中SBP bac 5的表达量差异.结果显示,重组蛋白获得高效表达,S.suis 7型强毒株WC0711中SBP bac 5表达量是弱毒株M13的3.8倍.     

鸡腺胃型传染性支气管炎病毒山东分离株S基因的克隆及序列分析

为研究3株鸡腺胃型传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株(青岛腺胃株QX株、东营腺胃株DY株、肥城腺胃株FC株)病毒纤突蛋白基因(S基因)的核苷酸特征,与呼吸型M41标准株及肾型IBV进行S基因核苷酸进行同源性比较。采用RT-PCR技术方法,对IBV分离株(QX、DY、FC)及标准毒株M41株S基因进行克隆和序列测定,对其中QX和DY株S基因核苷酸分别用3种方法(Clustal V method、Jotun Hein method和Clustal W method)对获得的基因核苷酸序列进行分析。结果显示,QX株和DY株的S基因核苷酸与标准毒株M41株S基因核苷酸的同源性最高为79.3%和79.2%,最小差异性为24.5%和22.3%。QX株和DY株与肾型IB分离株HD同源性最高为78.4%和78.9%,最小差异性均为22.7%。HD株与M41株的同源性最高达到80.8%。通过对S基因进化关系分析,说明腺胃型IBV山东分离株(QX、DY株)与呼吸型和肾型IBV是引起不同组织嗜性的IBV变异株,与呼吸型IBV和肾型IBV有明显的差异,是在IBV遗传变异进化过程中具有重要地位的进化阶段。     

RT-PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1糖蛋白基因 (引物A)和S1糖蛋白基因N_端高变区Ⅰ (引物B)的 2对引物对 3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及 5个地方分离株 (C60 ,D41A ,D41B ,A112 1,A1171)进行RT_PCR扩增。用引物A时 ,有 5个IBV毒株扩增到目的片段 (172 0bp) ;用引物B时 ,所有 8个IBV毒株均得到与预计大小相符的目的产物 (2 2 8bp)。对 172 0bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切 ,结果得出 3个不同的RFLP图谱 ,其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HaeⅢ酶切图谱。Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱 ;对 2 2 8bp的PCR产物进行DdeⅠ、RsaⅠ限制性内切酶消化 ,根据它们的RFLP图谱 ,8个IBV毒株可分为 5个基因型。综合 2对引物的PCR产物的RFLP分析结果 ,8个IBV毒株可分为 7个基因型 ,分型的结果与传统的血清学方法吻合。本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异、灵敏等优点 ,为现场流行毒株的定型(基因型 /血清型 )及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。