丹参C4H基因pET32a原核表达载体的构建

【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因（SmC4H）的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32a连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western Blot分析。【结果】克隆得到了1 200 bp大小的基因片段,经测序鉴定其为SmC4H基因片段;连接表达载体测序结果表明,SmC4H-pET32a构建成功,其诱导表达蛋白经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,重组蛋白表达效果较好,且主要以包涵体形式存在。【结论】成功构建了SmC4H-pET32a原核表达载体,并成功诱导了SmC4H-pET32a重组蛋白的表达。     

来航鸡FOXL2基因的真核表达及纯化

【目的】对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化,为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据GenBank已发表的来航鸡FOXL2基因序列(GenBank登录号:JF_708868.1)设计引物,以来航鸡全血DNA为模板,PCR扩增FOXL2基因,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后定向克隆于pPICZαA中,获得pPICZαA-FOXL2真核表达载体。将pPICZαA-FOXL2转化毕赤酵母菌GS115,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】克隆了918bp的FOXL2基因;成功构建了pPICZαA-FOXL2真核表达载体;实现了FOXL2基因在毕赤酵母菌GS115中的融合表达,获得了分子质量约为37ku的重组蛋白FOXL2,经Western blotting检测其具有较好的生物学活性。【结论】成功地在毕赤酵母中表达了来航鸡FOXL2基因。     

香蕉枯萎病菌遗传多态性及其致病力分化

为了明确我国香蕉主要种植区香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC）的致病力及其遗传多态性,本研究采用对寄主鉴定和RAPD技术分析来自海南、广西、广东、福建、云南的FOC 生理小种、致病力分化及遗传多态性。结合巴西蕉和粉蕉鉴定与RAPD技术,与香蕉枯萎病菌1号（FOC1）和4 号生理小种（FOC4）对比,55 个FOC 菌株中,有28 个菌株属于1 号生理小种、海南10 个、广西8 个、广东4 个、福建4 个、云南2 个;27 个菌株属于4 号生理小种,海南20 个、广西4 个、广东1 个、福建1 个、云南1 个。强致病力菌株有23 个菌株,中致病力菌株有15 个,弱致病力菌株有17 个;通过遗传多态性分析,9 条引物PCR扩增供试菌株,共扩增出136 条谱带,其中多态性的条带有126 条,多态性位点频率为93.4%,在遗传阈值为0.68 时,55 个供试菌株与FOC1 和FOC4划分为4 个RAPD 菌群,除1 号生理小种BF26 菌株单独形成郁菌群外,4 号生理小种和其余1 号生理小种均未单独形成菌群,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群同时含有1号和4号生理小种。因此,我国香蕉种植区香蕉枯萎病菌仍以1号和4 号生理小种为主,但是生理小种的遗传分化在分子水平上趋于复杂化,香蕉枯萎病菌群体具有丰富的多态性,其致病力的强弱和菌株遗传关系无直接的相关性,跟地理分布也没有相关性,香蕉枯萎病菌的遗传多态性可能更多依赖其寄主。这些结果为香蕉的抗病育种、品种的合理布局以及香蕉枯萎病的综合防治提供理论依据。     

香蕉枯萎病高效拮抗土著细菌的筛选及其防效

【目的】发掘防治香蕉枯萎病的高效生防菌资源,为有效控制香蕉枯萎病的发生提供参考。【方法】利用选择性培养基从福建省香蕉产区野生香蕉根际土壤中分离菌株,以香蕉枯萎病菌为靶标,采用平板对峙法、代谢物抑菌试验、抑菌谱和耐毒素能力测定筛选具有拮抗活性的生防细菌;通过形态学观察、生理生化特性测定、16S rDNA和gyrA基因序列分析及构建系统发育树进行生防菌株的鉴定,并采用灌根法测定生防菌株对香蕉枯萎病的防治效果。【结果】利用选择性培养基从野生香蕉根际土壤中分离到195株细菌,以香蕉枯萎病菌为靶标,采用平板对峙法筛选出对香蕉枯萎病菌具有拮抗活性的细菌17株,其中菌株NJ-1和NJ-4对香蕉枯萎病菌的抑菌带宽度分别达12.67和11.67 mm;不同拮抗细菌菌株间的代谢物对香蕉枯萎病菌的抑制率存在差异,其中菌株NJ-1和NJ-4的抑菌效果较好,抑制率分别达89.06%和88.47%。菌株NJ-1和NJ-4对12种植物病原真菌均具有较好的抑制作用,抑菌谱广,且对5%的香蕉枯萎病菌粗毒素具有一定的耐受性。经菌落形态、生理生化特征及分子鉴定,菌株NJ-1和NJ-4分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。盆栽试验结果表明,菌株NJ-1和NJ-4对香蕉枯萎病具有较好的防治作用,其防治效果分别为71.69%和70.75%,且与对照药剂450 g/L咪鲜胺水乳剂1 000倍液处理相比,菌株NJ-1和NJ-4对促进香蕉苗株高、根长生长有显著优势。【结论】菌株NJ-1和NJ-4对香蕉枯萎病具有高效的生防潜力,而且对香蕉生长具有一定的促进作用。     

维氏气单胞菌AcrV基因的克隆与原核表达

【目的】克隆维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）低钙反应蛋白（AcrV）并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,进行EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对 pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度（0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L）和诱导时间（2,3,4和5 h）进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。     

苹果ACO1转录因子MdHB1基因的克隆及其真核表达载体的构建

【目的】通过生物信息学分析,将苹果的一段EST序列初步定性为转录因子MdHB-1基因,对该基因进行克隆和真核表达载体构建,为进一步研究其分子生物学功能奠定基础。【方法】根据番茄LeACO-1转录因子LeHB-1的基因序列,对苹果EST库进行Blast,获得一段EST序列,根据该EST序列设计1对特异性引物,以“皇家嘎啦”苹果花器总RNA为材料,经RT-PCR得到1条长约1 000 bp的cDNA片段,T/A 克隆后进行序列测定及分析。将基因MdHB-1与真核表达载体pPICZA连接,构建真核表达载体pPICZA-MdHB-1,并导入毕赤酵母菌种GS115,通过 PCR鉴定该载体的导入情况。【结果】克隆到苹果MdHB-1基因(GenBank登录号为JQ678788),其开放阅读框为1 011 bp,编码336个氨基酸。Blastn和Blastp序列比对分析发现,MdHB-1与已登录的其他物种的HB-1基因相似性达50%～60%。该基因编码的氨基酸中存在保守序列HD-Zip结构域,该保守序列与已经报道的番茄LeHB-1、拟南芥AtHB-1的保守序列的同源性均大于85%。重组表达载体PICZA-MdHB-1构建正确并已成功导入酵母基因组中。【结论】成功克隆了苹果转录因子MdHB-1基因全长,并正确构建了其真核表达载体。     

西瓜类甜蛋白家族全基因组鉴定及表达

【目的】对西瓜类甜蛋白家族基因（ClTLP）进行全基因组鉴定和序列特征及聚类分析,研究其在西瓜不同组织及病原菌胁迫下的表达模式,为进一步开展类甜蛋白家族基因的功能鉴定及其与枯萎病菌互作机制研究奠定基础。【方法】利用生物学软件对ClTLP进行序列特征及聚类分析,采用qRT-PCR技术检测ClTLP基因在西瓜根、茎、叶组织及枯萎病菌侵染不同时间（0,12,24,48,120,168 h）后的表达情况。【结果】从西瓜基因组中共鉴定到28个西瓜TLP家族基因,TLP基因分布在 8条染色体上,主要有4种结构类型,蛋白保守,氨基酸基序高度一致。在基因启动子区发现多个激素响应元件和胁迫响应元件。西瓜类甜蛋白归属10个聚类群。多数ClTLP基因在西瓜不同组织中表现为组成型表达,在根中的表达量高于茎和叶片。枯萎病菌侵染可以诱导大部分ClTLP基因的表达,且多数基因表达量在侵染后120 h最高。其中,Cla97C01G019790和Cla97C10G185250的表达随枯萎病菌侵染时间延长逐渐升高,而Cla97C10G204510和Cla97C10G185260的表达受到了枯萎病菌胁迫抑制。【结论】西瓜类甜蛋白家族有28个成员,其大多数CITLP基因的表达量在根中最高,可受枯萎病菌诱导,在西瓜抵御病原菌侵染过程中发挥重要作用。     

马铃薯 StMKK1基因RNAi干扰载体的构建及遗传转化

丝裂原活化蛋白激酶MAPK级联反应在植物响应生物与非生物胁迫中发挥着重要作用。为了获得转基因马铃薯,进一步探索 StMKK1在信号转导和胁迫响应中的功能,从四倍体栽培品种马铃薯Desiree 的cDNA中克隆到 StMKK1基因302 bp的目的片段,并将目的基因的正向片段利用EcoRⅠ和KpnⅠ,反向片段利用HindⅢ和XbaⅠ与重组载体35s-pART27进行连接,构建成35s- StMKK1-pART27-RNAi表达载体;利用农杆菌介导的遗传转化方法,将35s- StMKK1- pART27-RNAi载体导入马铃薯品种Desiree中,得到7株沉默的阳性马铃薯转基因植株,不同的转基因植株中 StMKK1基因的沉默效率经检测均在92%以上。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌１号和４号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。     

草原短尾羊Brachyury蛋白多克隆抗体制备

【目的】克隆草原短尾羊Brachyury基因（即T基因）编码区（CDS）,并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。【方法】提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brachyury基因CDS全长序列连接至pEASY-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury,并进行Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB（DE3）大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA（iELISA）法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。【结果】克隆了1 335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。【结论】成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T—DNA插入突变体的筛选

【目的】通过农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量（试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度）试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为：农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25 ℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化,转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌4号小种在各培养基上性状比较

通过K2、PPA、MBA和PSA等培养基对香蕉枯萎病菌4号小种的选择性和鉴别作用进行比较,结果表明,K2培养基抑制杂菌的能力强,适宜香蕉枯萎病菌4号小种生长,齿轮状菌落是该小种的鉴别特征.利用K2培养基从土壤中检测出的菌株在香蕉组培苗上进行致病性测定,确认该菌株为香蕉枯萎病菌4号小种.因此,K2培养基可以作为香蕉枯萎病菌4号小种的鉴别培养基,用于土壤、香蕉苗和田间病株中香蕉枯萎病菌4号小种检测.     

广西香蕉枯萎病4号生理小种发生情况及香蕉品种抗性鉴定

【目的】明确香蕉枯萎病4号生理小种在广西的发生实况和广西现有香蕉品种对香蕉枯萎病4号生理小种的抗性水平,为制定相应的防控措施提供参考。【方法】在广西香蕉产区随机选择23个村,每村抽取2～3个点,调查香蕉枯萎病4号生理小种的发生情况。用伤根接种法测定11个香蕉品种对香蕉枯萎病4号生理小种的抗性水平。【结果】南宁市西乡塘区、隆安县、钦州市、武鸣县和龙州县均发现香蕉枯萎病4号生理小种发生为害,大多数发病地块的病株率在1．00%-14．00％,病情指数在0．50～10．00,田东县调查点没有发现香蕉枯萎病4号生理小种为害。11个香蕉品种除金粉1号病情指数为50．00,为感病品种（s）外,其他品种病情指数在70．00～100．00,为高感品种（HS）。【结论】香蕉枯萎病4号生理小种已在广西部分产蕉区零星发生,正处于病原菌菌量累积阶段;目前广西栽种的香蕉品种均为感病或高感品种,抵御能力差,需加强对香蕉枯萎病的防控力度。     

广东香蕉枯萎病菌生理小种的鉴定

以4～5片叶的组培香蕉苗和粉蕉苗为材料,采用伤根浸菌液的接种法对分离自番禺、中山、肇庆、珠海、顺德等地的香蕉枯萎病菌株进行了致病性测定,同时观察了各菌株在Komada改良培养基上菌落形态特征.结果表明在广东的确存在香蕉枯萎病菌1号和4号2个小种,认为致病性测定结合Komada改良培养基上菌落形态特征是鉴定香蕉枯萎病菌生理小种的简单、快速而又可靠的方法.     

香蕉枯萎病菌fgb2基因的克隆与序列分析

为了解fgb2基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种之间的致病力差异关系,采用PCR和RT—PCR方法扩增了2个生理小种的fgb2基因,并对其扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,同时还对其基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析。结果表明,2个生理小种fgb2基因开放阅读框分别为1466bp和1452bp,基因同源性为96．33％;其编码的氨基酸数量分别为299个和316个;从．詹62基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列来看,2个生理小种的致病力差异与詹62基因并无明显对应关系。     

木霉菌及其代谢产物对香蕉枯萎病菌的离体抑制作用研究

离体测定了22株木霉菌及其代谢产物对香蕉枯萎病菌4号生理小种的抑制作用,结果表明采用平板对峙培养,木霉菌对香蕉枯萎病原菌菌丝生长的抑制率为61.76%~100.00%,20%(V/V)木霉菌发酵液对病原菌菌丝生长抑制率为11.83%~52.69%,而木霉菌产生的非挥发性代谢产物和挥发性代谢产物对病原菌菌丝生长抑制率分别为3.83%~74.62%和11.17%~29.37%。用20%~50%(V/V)木霉菌T05-049发酵液处理香蕉枯萎病菌球型分生孢子9 h和镰刀型分生孢子6 h,其孢子萌发抑制率分别为86.60%~96.40%和56.29%~85.41%。     

不同地区香蕉枯萎病菌4号生理小种生物学特性及ITS序列分析

香蕉枯萎病菌4号生理小种的传入给我国香蕉产业带来严重威胁。利用核糖体基因(rDNA)及其内转录间隔区(ITS)序列分析对采自广东省和云南省不同地理环境的香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株进行系统发育研究。结果表明,广东和云南两省菌株的遗传距离为0.002,两省菌株的同源性高达99.8%,以NJ法建立系统树分析表明,云南和广东两省菌株的亲缘关系很近,但仍存在一定差异。广东、云南不同地区菌株的生物学基本特性比较研究表明,两地区菌株在生长速率、菌落直径和产孢量等方面差异较大。与采自广东的菌株相比,采自云南的菌株接种香蕉后发病较早、产孢量高。此外,采自广东的菌株略嗜酸性,云南地区的菌株略嗜碱性。     

甜味蛋白Brazzein基因酵母表达系统的建立

根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys)。采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体。将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中。筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种产生毒素条件的优化

由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种(Foc 4)引起的香蕉枯萎病是世界性香蕉毁灭性病害之一,毒素是其重要的致病因子.为了获得香蕉枯萎病菌毒素,采用活体香蕉苗生物测定法观察了不同培养基、培养方式、培养时间、培养温度、Richard培养基初始pH值、摇床转速...