香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T-DNA插入突变体的筛选

[目的]通过农杆菌介导的遗传转化(ATMT)方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究.[方法]通过单因子变量(试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度)试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体.[结果]得到的最佳转化条件为:农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜.通过条件优化,转化效率可达到800~900个转化子/106个孢子.[结论]通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础.     

根癌农杆菌介导荸荠秆枯病菌转化体系构建及突变体筛选

【目的】建立农杆菌介导荸荠秆枯病菌(Cylindrosporium eleocharidis)的遗传转化体系,构建该病菌的突变体库并进行突变体筛选,为荸荠秆枯病病原菌的分子机理研究提供参考依据。【方法】运用农杆菌介导的真菌转化方法,将含有绿色荧光蛋白(GFP)的双元载体pEX4转化至荸荠秆枯病菌野生型菌株Ceh中,利用PCR、Southern blotting杂交和荧光显微镜检测等技术验证转化子。通过单因子变量[共培养基中的乙酰丁香酮(AS)、农杆菌诱导时间、病原菌孢子浓度、IM诱导培养基pH、共培养时间和共培养介质]试验,优化农杆菌遗传转化体系,并建立该病菌突变体库,分析突变体的形态变异和致病性。【结果】获得的最佳遗传转化条件为:共培养基中AS浓度为300μmol/L,农杆菌诱导时间6 h,真菌孢子浓度为10~7个/mL,诱导培养基pH 5.6,共培养时间72 h,共培养介质为硝酸纤维素膜。在该优化条件下,农杆菌遗传转化体系转化效率达600～700个转化子/10~7个孢子。随机挑取转化子进行PCR检测均为阳性,T-DNA单拷贝插入率达77.8%,荧光显微镜均可检测到荧光信号。【结论】成功构建了农杆菌介导的荸荠秆枯病病原菌遗传转化体系和T-DNA插入突变体库,并筛选获得表型和致病性缺陷突变体,可用于指导荸荠秆枯病菌基因功能和病菌与寄主互作研究。     

农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化

建立并优化了农杆菌介导转化瓜类炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)获得T-DNA插入突变体体系,包括农杆菌使用浓度、农杆菌与炭疽菌孢子共培养时间、抗生素配合使用抑制农杆菌污染等.所用的转化载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP除了抗生素选择标记外还携带有融合GFP-GUS报告基因.转化106个孢子平均可获得约150～200个潮霉素抗性转化子.PCR检测表明,所有潮霉素抗性转化子菌株都能从其基因组DNA中扩增到转化载体中的GUS基因片段,而且都能产生GFP荧光或GUS染色阳性.转化子菌株经过连续继代培养后保持稳定.随机对36个转化子菌株进行致病性测定,发现1个转化子菌株对黄瓜致病性下降,1个丧失致病性,而大多数表现为野生型致病性.农杆菌介导转化瓜类炭疽菌体系的建立,为进一步构建大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆鉴定奠定了基础.     

根癌农杆菌介导的玉米大斑病菌转化条件的优化

为构建大规模的玉米大斑病菌ATMT突变体库,本研究对根癌农杆菌介导的玉米大斑病菌的转化条件进行了优化,包括共培养温度与时间、孢子萌发时间、转化受体材料、共培养介质等。结果表明:头孢噻肟钠和羧苄青霉素浓度为200/200μg/mL时可有效抑制根癌农杆菌的生长;当玉米大斑病菌分生孢子萌发24 h后,在20℃条件下与根癌农杆菌共培养48 h,共培养介质为微孔滤膜时转化效果最佳,转化效率可达到90～110个转化子/105个孢子。     

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。     

根癌农杆菌介导的香蕉炭疽菌转化

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,以香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)的分生孢子为受体,pTHPR1为双元载体,成功实现了植物病原真菌香蕉炭疽菌的遗传转化.在诱导培养基pH 5.6、乙酰丁香酮200 μg/mL、共培养时间24 h等适宜条件下,最高转化率可达260个转化子/106个孢子.对转化子的PCR检测表明,T-DNA已整合到香蕉炭疽菌的基因组中,转化子的遗传表现稳定.     

层出镰刀菌T-DNA插入突变体库的构建与分析

苹果再植病害(Apple replant disease,ARD)是世界苹果主产区广泛发生的病害。前期研究表明,层出镰刀菌是造成苹果再植病害的重要致病菌之一,但其分子致病机制尚缺乏研究报道。本研究的目的是建立农杆菌介导的层出镰刀菌的遗传转化体系,并获得大规模的遗传稳定的层出镰刀菌ATMT突变体库,为研究该菌的分子致病机理奠定基础。对影响农杆菌介导转化效率的主要因子进行单因子条件测验,得到其最优转化体系为:抑制H10菌丝和孢子生长的潮霉素的浓度为100μg/mL,层出镰刀菌的分生孢子浓度为107个/mL,农杆菌OD600值为0.3,AS浓度为200μg/mL,共培养时间为48h,共培养温度为26℃。利用这一体系构建了3000个转化子的突变体库,并对随机选择的200个突变体进行潮霉素抗性基因的PCR检测,并经过在PDA培养基上5代培养,验证了T-DNA插入片段的稳定性。     

枣黑斑病菌绿色荧光蛋白标记菌株的构建

以枣黑斑病菌和含有双元载体根癌农杆菌为材料,对分生孢子悬浮液的浓度、农杆菌液浓度、菌株共培养时间、共培养温度等条件进行优化,筛选出枣黑斑病菌遗传转化的最佳体系。以农杆菌介导枣黑斑病菌最佳的遗传转化体系为基础,进行GFP标记实验室保存枣黑斑病菌的菌落,继代培养后,通过观察菌落生长形态,生长速度以及致病力测定筛选获得遗传相对稳定、与野生枣黑斑病菌相比性状没有发生明显变化的荧光蛋白标记菌株。挑取单菌落于10 ml的LB液体培养基(含100μg·ml~(-1)卡那霉素)中,28℃震荡(180 r/min)培养48 h,吸取400μl培养液于20 ml含有200μmol·L-1的AS(乙酰丁香酮,acetosyringone)、100μg·ml~(-1)卡那霉素的AIM液体培养基中,28℃震荡(180 r/min)培养5~6 h共培养。将Alternaria alternata菌株所产的孢子洗下,制成浓度为1.0×106个/ml的悬浮液。分别取上述农杆菌液与孢子悬浮液各100μl均匀混合,涂布于含有200μmol·L-1AS和100μg·ml~(-1)卡那霉素的AIM平板上的硝酸纤维化膜(NC膜)表面,在25℃下黑暗共培养60 h,然后将NC膜转到含有潮霉素B的PDA平板上4~7天,获得约200个转化子,获得GFP标记的菌株。     

农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定

【目的】优化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的技术体系,并对转化子进行筛选鉴定,比较其生物学特性和致病性差异。【方法】以苹果炭疽病菌LXS010101分生孢子为转化受体,利用携带重组双元载体的农杆菌进行转化;对获得的转化子进行遗传稳定性测定、PCR检测及Southern blot分析;选取一定数量的转化子,比较其菌落形态、生长速率及分生孢子发育等主要生物学性状及致病性的差异。【结果】苹果炭疽病菌的最优转化体系为：病菌分生孢子悬浮液浓度1×105个/mL,共培养温度和时间分别为22℃和24 h,共培养基中添加200 μmol•mL-1乙酰丁香酮,其转化效率达到1×105个孢子可获得439个转化子。随机选取30个转化子进行鉴定,发现T-DNA已整合进炭疽病菌基因组中,在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,且能够稳定遗传。与野生型菌株相比,转化子的菌落形态没有发生明显变化,但23.33%的菌株生长速率显著减低;转化子ATJ-3和ATJ-15不能产生分生孢子,在28个产孢菌株中,分生孢子萌发率显著减低的菌株占39.29%,附着胞形成比例显著减低和形态异常的菌株占25.00%。致病性测定结果显示,11个转化子的致病力显著降低,其中菌株ATJ-19完全丧失致病能力。【结论】优化的苹果炭疽病菌遗传转化技术体系,可用于炭疽病菌致病相关基因的克隆及致病分子机理的研究。     

根癌农杆菌介导火龙果溃疡病菌遗传转化体系的构建及转化子筛选

为了探究火龙果溃疡病病原菌的致病机理,笔者利用农杆菌介导的遗传转化技术,分析了根癌农杆菌浓度、分生孢子萌发时间以及共培养温度等3个主要因素对遗传转化效率的影响,建立火龙果溃疡病菌的遗传转化技术体系,并对转化子进行筛选。结果表明,当农杆菌浓度OD₆₀₀=0.5、分生孢子萌发时间24 h、共培养温度25 ℃时遗传转化效率最高（833个转化子/106分生孢子）;随机挑选200个转化子进行筛选,获得3株菌落形态与野生型菌株差异较大的转化子,4株产孢量减少的转化子,5株产孢量增加的转化子,6株致病力下降的转化子。     

稻瘟病生防菌对四种作物土传病害病原菌的抑制作用

利用稻瘟病生防菌(短小芽孢杆菌)对4种主要作物土传病害病原菌进行抑菌作用试验。结果表明,此生防菌对4种作物土传病害病原菌具有不同程度的抑制作用,100倍生防菌发酵稀释液对4种土传病原真菌--辣椒枯萎白绢病菌、节瓜枯萎病菌、香蕉枯萎病病菌、粉蕉根腐病菌生长抑菌率在41.18%以下,显著低于对稻瘟病菌生长的抑制率(69.85%);生防菌发酵原液对香蕉枯萎病菌的孢子萌发具有较好的抑制作用,抑制率达到86.67%,显著大于其他处理的抑制作用;但不同倍数的生防菌液对节瓜枯萎病菌的抑制差异不显著,抑制率介于76.34%~84.97%之间。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种中性海藻糖酶NTH1基因敲除和功能分析

为了研究中性海藻糖酶在香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc4-37）致病和耐受不良环境中的作用，笔者构建了中性海藻糖酶编码基因敲除突变体Δnth1，并对敲除突变体的致病力、生物学特性和对氰烯菌酯的抗药性开展测定分析。结果表明:与野生型相比，Δnth1菌落生长缓慢、孢子萌发率下降，对巴西蕉苗致病力明显减弱，但产孢量没有显著差异，对氰烯菌酯的敏感性（EC₅₀=6.07 mg·L?1）也无明显变化。由此推断NTH1基因参与调控香蕉枯萎病菌的分生孢子萌发和生长，参与细胞壁合成和氧化应激反应的应答，不参与FOC对渗透压力、高糖和高低温胁迫的应答。     

广东香蕉枯萎病菌生理小种的鉴定

以4～5片叶的组培香蕉苗和粉蕉苗为材料,采用伤根浸菌液的接种法对分离自番禺、中山、肇庆、珠海、顺德等地的香蕉枯萎病菌株进行了致病性测定,同时观察了各菌株在Komada改良培养基上菌落形态特征.结果表明在广东的确存在香蕉枯萎病菌1号和4号2个小种,认为致病性测定结合Komada改良培养基上菌落形态特征是鉴定香蕉枯萎病菌生理小种的简单、快速而又可靠的方法.     

香蕉枯萎病菌2个生理小种PL基因真核表达载体的构建与表达

【目的】构建香蕉枯萎病菌1号小种（FOC1）和4号小种（FOC4）果胶裂解酶（Pectate lyases, PL）基因的真核表达载体,并进行诱导表达,为进一步研究PL在病原菌致病过程中的作用奠定基础。【方法】将质粒pMD18-pl-foc1、pMD18-pl-foc4和真核表达穿梭载体pPICZαA进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应,回收目的片段连接,转化至DH5α进行筛选扩繁,对菌落进行PCR鉴定后抽提质粒进行PCR和EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定。将阳性载体线性化后电击转化毕赤酵母 SMD1168感受态细胞,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析。【结果】成功构建了FOC1和FOC4 PL基因的真核表达载体pPICZαA-pl-foc1和pPICZαA-pl-foc4,经甲醇诱导表达后分别获得了重组的PL蛋白,其分子质量约为23.4 ku。【结论】FOC1和FOC4 2个香蕉枯萎病菌小种的PL基因在酵母中得到了成功表达。     

尖孢镰刀菌FoPLC4参与调控孢子形成和致病性

【目的】黄瓜枯萎病是黄瓜生产中的重要病害,其病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）。研究旨在明确尖孢镰刀菌黄瓜专化型编码磷脂酶C（phospholipase C,PLC）的FoPLC4在调控分生孢子形成和致病性等方面的功能。【方法】采用生物信息学方法,确定FoPLC4在染色体上的位置,分析FoPLC4结构。基于尖孢镰刀菌番茄专化型基因组数据库,采用特异性引物克隆黄瓜枯萎病菌FoPLC4。根据同源重组原理构建携带潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase,HPH）基因的敲除载体,利用PEG（polyethylene glycol）介导的方法转化原生质体,获得黄瓜枯萎病菌的敲除突变体?FoPLC4和遗传回复突变体?FoPLC4/plc4。转化子经潮霉素B平板筛选后通过PCR和RT-PCR分子验证。在PDA（potato dextrose agar）培养基上测定?FoPLC4生物学性状。利用分生孢子接种黄瓜胚根测定?FoPLC4在黄瓜幼苗上的致病性。【结果】FoPLC4位于尖孢镰刀菌基因组的4号染色体,DNA全长3 282 bp,不含内含子,编码1 093个氨基酸;FoPLC4含有5个结构域,包括EF手形（EF-hand）区、PH（pleckstrin homology）区、C2区和2个催化区,属于PLCδ亚型。与野生型菌株相比,?FoPLC4菌落生长速率没有显著改变,但气生菌丝较疏松;?FoPLC4可以同时产生大型分生孢子和小型分生孢子,大型分生孢子只占孢子总数的12.1%,而野生型菌株在相同条件下只能产生小型分生孢子,?FoPLC4产孢量下降了82.2%。致病性测定表明?FoPLC4在黄瓜幼苗上的萎蔫症状明显减轻,接种10 d后病情指数下降了53.3%。回复突变体?FoPLC4/plc4在菌落生长、产孢和致病性等性状与野生型相比没有显著差别。【结论】尖孢镰刀菌黄瓜专化型FoPLC4全长3 282 bp,不含内含子,编码1 093个氨基酸。与野生型相比,?FoPLC4分生孢子的产孢类型明显改变、产孢数量和对黄瓜幼苗的致病性显著降低。FoPLC4在调控尖孢镰刀菌分生孢子形成和致病性中发挥重要作用。     

农杆菌介导尖孢镰刀菌西瓜专化型转化体系的建立及突变体筛选

以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)FO-11-06菌株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(含pATMT1)介导的西瓜枯萎病菌的转化,并研究了转化介质和pH值对转化效率的影响。结果表明:在25℃下,采用乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600=0.15、尖孢镰刀菌分生孢子含量为1×106个/mL、pH值为5.1～5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH值为5.3时,转化效率最高,达到每106个分生孢子产生553个转化子。不同共转化介质对转化效率影响明显,玻璃纸和硝酸纤维素滤膜转化效率较高,每106个分生孢子获得551个和549个转化子,显著高于滤纸。通过转化,获得尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子1 989个,对生长速度、菌落颜色和产孢量等性状进行分析,发现有46个性状特异的突变体。研究结果为进一步研究尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长发育、致病机制和相关基因的功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌１号和４号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。     

香蕉枯萎病菌4号小种在各培养基上性状比较

通过K2、PPA、MBA和PSA等培养基对香蕉枯萎病菌4号小种的选择性和鉴别作用进行比较,结果表明,K2培养基抑制杂菌的能力强,适宜香蕉枯萎病菌4号小种生长,齿轮状菌落是该小种的鉴别特征.利用K2培养基从土壤中检测出的菌株在香蕉组培苗上进行致病性测定,确认该菌株为香蕉枯萎病菌4号小种.因此,K2培养基可以作为香蕉枯萎病菌4号小种的鉴别培养基,用于土壤、香蕉苗和田间病株中香蕉枯萎病菌4号小种检测.     

香蕉枯萎病拮抗菌的筛选及抑菌作用研究

从香蕉园土壤中分离和筛选得到33株对香蕉枯萎病菌(Fusari um ox ysporumf.sp.cubense)有抑制作用的拮抗菌,对其进行了抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发的试验,结果表明:拮抗菌株G1、G3、F1、F3I、1发酵液对香蕉枯萎病菌的生长有显著的抑制作用,在平板上产生的抑菌圈直径为10.33~48.33mm,抑菌效果持续稳定;对孢子的萌发抑制率为92.50%~98.22%,拮抗菌的抑制作用表现为抑制病菌分生孢子的萌发,致使孢子芽管扭曲。     

一株香蕉枯萎病拮抗菌的筛选、鉴定及生防效果研究

【目的】筛选获得对香蕉枯萎病病原菌具有拮抗作用的菌株,为香蕉枯萎病生物防治提供菌株资源。【方法】以香蕉根际土壤为材料,利用铬天青（Chromeazurol S,CAS）双层平板法和平板对峙法筛选可分泌铁载体且对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的菌株;通过平板对峙法测定拮抗菌株对6种常见植物病原菌的拮抗活性;通过形态学观察、生理生化测定和16S rDNA序列分析明确拮抗菌株的分类地位;通过盆栽试验验证拮抗菌株对香蕉枯萎病的防治效果及对香蕉植株的促生作用。【结果】经CAS培养基初筛,从土壤中分离获得60株可分泌铁载体的菌株,平板对峙法复筛得到5株拮抗作用较强的菌株,其中菌株Gxun-2的抑菌效果最强,平均抑菌率达74.45%,且对供试的其他6种植物病原菌均具有较好的抑制效果,具有广谱抗菌性。结合菌落形态、生理生化及16S rDNA进化树分析结果,菌株Gxun-2鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。盆栽试验显示,菌株Gxun-2对香蕉枯萎病具有较好的防病作用,防治效果达84.21%,且对香蕉植株具有一定的促生效果,香蕉苗鲜重较对照增加32.96%。【结论】菌株Gxun-2对香蕉枯萎病具有较好的防治作用,且对香蕉植株具有一定的促生效果,可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源。