朊蛋白（prp23—231）酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

PCR扩增小鼠朊蛋白（prp23-231）基因,克隆入诱饵载体psos,将重组质粒与对照质粒共转化酵母菌cdc25H,成功地构建了小鼠朊蛋白（prp23-231）酵母双杂交诱饵载体pSos-prp23～231,并证实该段基因表达的蛋白对酵母菌cdc25H既无毒性,也没有自激活作用。     

牛肌生成抑制素基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

采用RT- PCR技术扩增牛肌生成抑制素基因成熟片段,并克隆入质粒pSos中,测序鉴定后获得酵母双杂交诱饵重组质粒pSos-MSTN.将诱饵重组质粒与对照质粒转化入酵母菌cdc25Hα中.结果表明:该段基因表达的蛋白对酵母菌cdc25Hα无毒性和无自激活作用,这说明可以用此酵母双杂交系统对牛肌生成抑制素进行研究.     

朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体的构建和鉴定

对小鼠朊蛋白（prp105—125缺失）的基因片段进行扩增,并将扩增片段导入诱饵载体pSos中构建酵母双杂交诱饵载体pSos-prp朊蛋白（prp105—125缺失）,用重组质粒转化感受态酵母菌cdc25H,检验其表达产物在酵母细胞中有无毒性及自激活作用。序列分析结果表明,该试验成功构建了小鼠朊蛋白（prp105-125缺失）酵母双杂交诱饵载体,且该诱饵质粒的表达产物对酵母菌cdc25H既无毒性也无自激活作用。     

羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。     

CMV 2b和ToMV CP酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活效应检测

通过RT-PCR从CMV和ToMV新疆分离物中扩增出CMV 2b和ToMVCP这2个基因,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用和对酵母细胞温敏特性影响。结果表明,这2个诱饵载体构建成功,对酵母菌株cdc25H无毒性和对Sos恢复系统无激活作用。为利用酵母双杂交系统研究加工番茄病毒的感染机制和病毒-寄主相互作用及防治加工番茄病毒病奠定了基础。     

橡胶树蔗糖转运蛋白基因SOS酵母双杂交体系的诱饵载体构建及自激活检测

为了筛选巴西橡胶树蔗糖转运蛋白（HbSUT）的互作蛋白质,构建了以SOS恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的6个HbSUT基因的诱饵载体,并进行了自激活检测。通过PCR技术从携带HbSUT基因的质粒中获得预期的基因编码序列,将目标片段定向插入诱饵载体pSOS的SalⅠ及NotⅠ酶切位点之间,酶切和测序结果表明,获得了序列和读框正确的6个HbSUT基因的诱饵载体pSOS-SUTs,进一步导入酵母温度敏感酵母cdc25H菌株中,检测其表达产物对酵母SOS恢复系统Ras信号通路的激活作用,除pSOS-SUT5外,其他5个诱饵载体对酵母菌株均无激活作用,因而适合于进行后续互作蛋白质筛选研究。     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位在酵母系统中的表达

【目的】构建幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)P58亚单位酵母双杂交诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与空泡毒素P58亚单位相互作用的蛋白奠定基础。【方法】采用PCR方法,从幽门螺杆菌s1/m1型标准毒株NCT11637基因组中扩增空泡毒素P58亚单位,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后克隆入经同样酶切处理的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,构建pGBKT7-VacA P58重组质粒,并将其转化E.coliDH5α,提取质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切、测序鉴定正确后,转化入宿主酵母菌AH109,色氨酸(Trp)缺陷压力筛选,对阳性转化酵母菌扩大培养,提取总蛋白进行Western-blot鉴定,同时检测重组蛋白有无毒性、渗漏和自激活活性。【结果】成功扩增长度为1202bp的空泡毒素P58片段,重组质粒pGBKT7-VacA P58经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切可得到1202bp大小的片段,测序结果显示扩增产物序列与参考序列完全匹配。重组质粒pGBKT7-VacA P58成功地转化至酵母细胞AH109中。表达的诱饵蛋白无毒性、无渗漏及无自激活活性,Western-blot分析证实酵母菌AH109细胞正确表达了重组蛋白。【结论】成功构建了幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位酵母诱饵表达载体,其可在酵母菌系统中成功表达,且表达产物正确。     

稻瘟菌蛋白激发子在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1,并在其上下游分别引入酶切位点EcoRI和XhoI,经双酶切后与诱饵质粒载体pLexA连接构建重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,将该重组诱饵质粒转入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中进行β-半乳糖苷酶整板分析检测自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为筛选番茄cDNA文库获得诱饵蛋白PemG1的相互作用蛋白奠定了基础。     

新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu。     

拟南芥AtGRP7基因诱饵载体的构建及酵母双杂的初筛

AtCRPI基因是拟南芥的一个从动振荡器基因,目前其生理功能知之甚少。为了更好地研究与AtCRP7基因的互作蛋白,笔者利用PCR技术从携带AtGRP7基因序列的质粒中扩增该基因的编码序列,然后将目标序列插入pGBKT7载体的NcoⅠ和PstⅠ2个酶切位点之间,构成酵母双杂体系的诱饵载体。酶切和测序结果表明,构建的载体目标基因序列和阅读框是正确的。之后,将该载体转入感受态酵母Y2HGold菌株中,并检测其表达物对报告基因的激活情况。AtGRP7酵母转化菌在SD／-Tip平板上长势良好;在SD／-Trp-Ade平板上长势较弱;在SD／-Trp／-His和SD／-Trp／-Ade／-His平板上则没有生长。这说明His合成相关基因没有被转录和翻译,AtGRP7基因在该酵母双杂体系中没有自转录激活。笔者在酵母双杂的初步筛选中,还获得几个可能与AtGRP7互作的基因。     

拟南芥NiNJA基因酵母双杂诱饵载体构建及互作蛋白的筛选

JAZ蛋白是植物茉莉酸信号途径的重要负调控因子,JAZ与NiNJA形成蛋白复合体抑制茉莉酸下游转录因子的转录活性,NiNJA蛋白是联系JAZ蛋白与下游转录因子的重要因子.为了研究NiNJA调控的下游基因,首先构建了NiNJA基因的诱饵载体pGBKT7-NiNJA,然后转化酵母Y2H Gold感受态,通过自转录激活实验,发现诱饵载体pGBKT7-NiNJA没有自转录激活活性.在此基础上,从拟南芥“Mate&PlateTM”Library 进行酵母双杂筛选,获得若干个与NiNJA互作的蛋白,为下一步鉴定NiNJA的互作蛋白及茉莉酸的信号调控途径打下基础.     

葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2互作蛋白筛选与鉴定

【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2,获得VvRR2的互作蛋白,为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌,提取总RNA后反转录,利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应;构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析;构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2,转化酵母菌株AH109,检测VvRR2的转录激活活性;构建酵母表达cDNA文库,以VvRR2为诱饵,通过Mating法筛选互作蛋白,对获得候选序列进行Blast分析;将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA,与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母,进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用;将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体,形成重组载体pSPYNE-VvTGA,将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体,形成重组载体pSPYCE-VvRR2,然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体,利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后,细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核,转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L^-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性,VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵,初步筛选到287个单克隆,在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列,Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长,含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长,并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光,而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2,呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子,能够与VvTGA相互作用,并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。     

Lescpth5诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

[目的]构建诱饵载体pGBKT7-Lescpth5,并检测其转录自激活活性及对酵母细胞的毒性。[方法]采用PCR技术扩增Lescpth5基因,连接到诱饵载体pGBKT7上,转化重组载体于酵母感受态细胞AH109中,在营养缺陷型培养基上进行自激活检测和毒性检测。[结果]酶切和测序鉴定结果显示诱饵载体pGBKT7-Lescpth5构建成功,读码框正确。自激活检测结果和毒性检测结果显示诱饵载体对酵母菌株AH109没有转录激活活性,对酵母菌也无毒害作用。[结论]成功构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步的cD-NA文库筛选奠定基础。