转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测通用标准分子的构建

将转基因大豆、玉米和水稻的主要外源Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT 基因和内参RBCL基因目标片段分别克隆到克隆载体pMD18-T中,构建获得的质粒可作为定性检测3种转基因粮食作物的上述外源基因的通用标准分子质粒pMD18-T-PAT-CP4-EPSPS-Cry1A(B)-BAR-RBCL,长约4.7 kb.经过双酶切、测序及PCR扩增,获得与预期片断大小及序列一致的目的基因片段,证明所构建的标准分子质粒是正确的,可以用来作为不同品种转基因粮食作物定性检测CP4-EPSPS基因、Cry1A(B)基因、BAR基因和PAT基因的通用阳性标准分子.     

基于TaqMan实时荧光PCR检测植物中转基因成分

转基因植物的安全性一直备受关注,转基因成分检测是保障食品安全、维护消费者知情权的重要手段。本研究构建并鉴定了pCry3A、pCry1A (c)、pCP4-EPSPS和p CTP2-CP4-EPSPS 4种阳性质粒,并在转基因棉花、转基因大豆、转基因小麦、转基因玉米、非转基因玉米中分别检测玉米内源基因(adh1)、抗虫基因(Cry3A、Cry1A (c))和抗除草剂基因(CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS),最后将转基因棉花和转基因大豆DNA模板原液进行梯度稀释确定Cry1A (c)和CP4-EPSPS的检出限,通过检出限检测建立标准曲线确定此方法的转基因成分定量检测能力。结果表明:4种阳性质粒鉴定结果良好,可以作为转基因检测的阳性对照;转基因棉花为转入Cry1A (c)基因的抗虫棉;转基因大豆为转入CP4-EPSPS基因的抗除草剂大豆;转基因小麦为转入Cry1A (c)基因的抗虫小麦;转基因玉米为转入Cry1A (c)、CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS基因的混合转基因玉米; Cry1A (c)和CP4-EPSPS的引物和探针的检出限均可达0. 1ng;建立的2种标准曲线的R2≥0. 95,说明引物和探针可以满足定量检测要求。本研究对Taq Man实时荧光PCR法检测植物中的转基因成分提供一些借鉴,同时为保障食品安全、维护消费者知情权提供方法支持。     

基于多重串联式PCR的基因碟片技术检测转基因作物

【目的】建立基于多重串联式PCR（multiplexed tandem PCR,MT-PCR）的基因碟片技术,并使之应用于转基因作物的大量、快速和稳定地检测。【方法】以转基因作物研究中常用的调控序列NOS终止子、FMV35S启动子及外源基因NPTⅡ、Cry1Ab、Cry1Ab/Ac、CP4-EPSPS、PAT和玉米内源基因IVR、棉花内源基因sad1、菜籽粕内源基因PEP为检测对象,针对每个基因设计内外2对引物,先进行一次循环数较少（10-20 cycles）的高通量多重PCR,以便在均匀地扩增各基因和调控序列的同时避免引物之间的竞争,然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因和调控序列,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。【结果】该方法能够快速（＜2 h）、高通量、准确地（＞0.000292 ng）检测出棉花、玉米、大米、菜籽粕中的多种转基因成分,可以分辨出3种转基因物种,适合大批量检测。【结论】该方法适合转基因作物的高通量、定量检测,具有较好的应用前景。     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。     

玉米转基因成分的检测

基于实时荧光PCR技术,通过构建阳性质控,对一种玉米样品进行多种转基因成分分析。首先,筛选出玉米样品中常见的外源转基因片段,构建阳性质粒并对阳性质粒进行验证;然后,对样品中可能含有的调控元件、目的基因以及筛选基因进行检测分析。实时荧光PCR检测结果表明,转基因玉米样品中含有2种启动子(pCaMV35S和pRice-Actin)、2种终止子(tNOS和tCaMV35S)、3种目的基因[Cry1A(c)、CP4-EPSPS和CTP2-CP4-EPSPS]以及1种筛选基因(PMI)。因此所检测的玉米样品中含有多种转基因成分,推测其转基因玉米样品含有多种转基因玉米品系。     

Construction of a General Standard Molecule for the Qualitative Detection in Different Transgenic Foodcrops

Now every laboratory is facing a common problem that is seriously lacking in the standard reference molecule in the GMC detecting research center. Constructing the recombinant plasmid is the urgent demand. In order to overcome this problem, this study respectively cloned CrylA（B）, BAR, CP4-EPSPS, PAT and RBCL genes into PMD 18-T vector. This constructed plasmid could be used as the standard reference molecule in the qualitative detecting of the exogenous CP4-EPSPS gene, CrylA（B） gene, BAR gene and PAT gene. Identification by double restriction endonuclease digestion and identification by PCR proved that the test result was positive. All of these indicated that the established reference molecules in this study were suitable for the qualitative analysis standard of this GMC detection.     

复合性状转基因玉米外源蛋白的时空表达规律

应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量检测转基因玉米MON89034×NK603的3个复合性状转基因玉米中Cry1A.105、Cry2Ab2、CP4-EPSPS蛋白在各组织中的表达量,分别取苗期和心叶期叶片、吐丝期花粉和花丝、灌浆期籽粒、雌穗顶端和茎髓组织进行检测。结果显示,3个转基因品种中,外源基因在各组织中的表达显示较高的一致性,均在叶片组织表达最高。转化体同一组织中表达外源蛋白在品种间变异不明显,组织间差异大于品种差异。     

转基因耐除草剂大豆及产品中外源成分检测方法的建立

分别从DNA和蛋白质2个水平上对转基因耐除草剂大豆及其产品的检测方法进行了研究．设计合成引物检测大豆内参照基因Lectin（大豆凝集素）及转基因抗除草剂Roundup Ready大豆外源基因,包括来自土壤细菌Agrobacterium tumefaciens株系CP4的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3phosphate synthase,EPSPS）基因、花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaicvirus,CaMV）35S启动子、胭脂碱合酶3’端的转录终止子（nopaline synthase,NOS）．应用优化的常规PCR方法,对大豆及其加工产品进行了检测,检测灵敏度可达0．1％．通过PCR方法从转基因大豆中扩增出CP4-EPSPS基因,在大肠杆菌中表达,利用表达的外源蛋白质作为抗原免疫家免,得到该蛋白质的多克隆抗体,并建立了一套基于蛋白质印迹杂交（western hybridization）的检测转基因大豆及其粗加工品的方法,其检测极限达到1％以下．此两方法互相配合,互相印证,有助于规范化转基因检测方法的建立．     

转基因水稻深加工产品两种荧光定量方法的比较研究

根据转基因水稻中外源基因Cry1A(B)和内源基因SPS设计SYBR Green I引物、TaqMan引物和荧光探针,以内源基因SPS作为内参照,使用两种FQ-PCR方法对水稻深加工产品中转基因水稻的含量进行定量检测.建立了转基因水稻标准品Cry1A(B)和SPS之间的△Ct与样品中转基因水稻含量百分比之间的校正曲线和...     

低盐固态发酵酱油生产过程中大豆DNA降解变化

为研究酱油生产过程中大豆DNA降解情况,为酱油生产不同阶段大豆转基因成分检测提供引物序列和检测方法,用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取大豆和蒸煮后大豆DNA,针对内源大豆凝集素基因和外源抗草甘膦基因设计引物进行PCR扩增;用试剂盒提取成熟酱醅、生酱油和酱油中的DNA,进行PCR扩增或巢式PCR扩增。结果表明,高温高压蒸料后大豆DNA片段长度降解到1 500 bp以下,发酵后的酱醅中检测不到500 bp左右大豆DNA片段。生酱油和成品酱油经大豆DNA提取和PCR扩增未见条带,用巢式PCR扩增可以检测到200 bp以下的内源基因、外源基因DNA片段。低盐固态发酵酱油生产过程中造成DNA片段长度降解的2个主要工艺是蒸煮和发酵,淋油过程去除了大量大豆DNA,成品酱油可用巢式PCR进行转基因成分检测。     

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

应用巢式及复合PCR对小鼠早期胚胎进行性别鉴定

根据小鼠SRY基因，设计并合成内外两对巢式PCR引物；同时。根据ZFY—ZFX基因的同源性，设计合成其共同的巢式PCR引物，对昆白小鼠组织DNA样品进行了性别鉴定。雄性样品可扩增262bp的SRY基因和137bp的ZFY—ZFX基因片断，而雌性样品只能扩增137bp的ZFY-ZFX基因片断，其鉴定结果与已知性别一致。将2-细胞、4-细胞、8-细胞和16细胞胚胎视为微量细胞样品进行PCR扩增，通过常规PCR与巢式PCR、复合PCR的比较。确立了巢式及复合PCR的扩增体系。结合核型分析和PCR法共鉴定21枚胚胎，其中雄性12枚，雌性8枚，鉴定准确率为95．2％。     

Identification and Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in Infected and Subclinically Infected Pigs by Multiplex PCR Based on the Genes ApxIVA and OmlA

PCRs based on different genes of Actinobacillus pleuropneumoniae have been developed for detecting and identifying A. pleuropneumoniae. Some of them could amplify positive fragments from the phylogenetically closely related species bacteria. To improve veracity and specificity of PCR, a species-specific multiplex PCR assay was developed to identify and detect A. pleuropneumoniae, based on the 3＇-terminus of the species-specific apxlVA gene and the already existing species-specific primers in the omlA gene. Both 346-bp and 950-bp fragments could be simultaneously amplified from all A. pleuropneumoniae reference strains and isolates, and the species specificity of the assay was evaluated with a collection of ten strains representing eight different species bacteria including species normally found in the respiratory tracts of swine. All of these strains turned out negative in the multiplex PCR. All sequences of products of multiplex PCR randomly sampled were also correct. The sensitivity of the multiplex PCR was determined to be 10 pg of A. pleuropneumoniae DNA. The multiplex PCR and bacterial isolation were compared to determine their sensitivities by using experimentally infected pigs and clinical disease pigs. The multiplex PCR was more sensitive than bacterial isolation. The multiplex PCR was also evaluated on mixed bacterial cultures from clinical healthy pigs. 26/100 （26%） of the subclinically infected pigs were detected from clinical healthy pigs. The results indicate that the multiplex PCR assay is a sensitive, highly specific, and effective diagnostic tool for identification and detection of A. pleuropneumoniae.     

多重PCR快速检测槟榔黄化植原体和槟榔隐症病毒1体系的建立

由槟榔黄化植原体(arecapalmyellowleafphytoplasma,AYLP)引起的黄化病和槟榔隐症病毒1(Areca palm velarivirus 1, APV1)引起的黄叶病毒病是危害槟榔树最严重的两种病害,对海南槟榔产业造成了巨大的经济损失,建立快速的检测技术对于两种病害的预警防控具有重要意义。利用多重PCR(Multiplex PCR)技术同时检测AYLP和APV1,即AYLP巢式PCR第一轮结束后,再使用一次多重PCR对两种病原同时进行扩增,最后进行电泳观察结果。结果显示,通过对多重PCR浓度体系和退火温度进行优化,在一个体系中成功扩增出AYLP和APV1,得到525和311 bp两条特异性大小条带。多重PCR检测与单一PCR检测结果完全一致,并且与单一PCR检测方法比较,多重PCR方法精简了操作步骤,提高了检测效率,显著降低了检测成本,为槟榔黄化病和黄叶病毒病的常规诊断提供了新方法。因此,该技术在AYLP和APV1常规检测中具有重要的应用价值。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

耐草甘膦转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系的建立及应用

【目的】建立一种精准、高效的草甘膦抗性基因G2-EPSPS和GAT的检测方法,为转基因大豆新品系ZH10-6的广泛应用提供技术支持。【方法】根据抗草甘膦大豆ZH10-6和受体中黄10的分子特征,设计大豆内源参考基因（Actin）、外源基因（G2-EPSPS和GAT）以及侧翼序列（G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2）的特异性引物,通过PCR扩增测试引物的特异性和适用性。调整引物配比、DNA模板量、dNTP含量、退火温度和延伸温度等,筛选该多重PCR体系的最适扩增条件。将转基因大豆ZH10-6和受体中黄10的基因组DNA按质量比混合,制备成100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0的DNA样品,进行灵敏度检测。运用建立的多重PCR体系检测转基因大豆ZH10-6不同地理来源的11份衍生品系,并根据鉴定结果对该体系的应用性进行评价。【结果】建立的多重PCR方法中引物GmActin11 F/R、G2-EPSPS F/R、GAT F/R、ZH10P1/GAT和G2/ZH10P2可分别扩增出转基因大豆ZH10-6大小为126、430、338、810和1 626 bp的特异性目标条带。用该方法扩增受体中黄10时,除了GmActin11 F/R可以扩增出126 bp目标条带,侧翼序列上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2也可以扩增出632 bp目标条带。多重PCR最适扩增体系为DNA模板量100 ng、5 U·μL^-1 Ex Taq 0.2 μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、2.5 mmol·L^-1 dNTP 2 μL、10 μmol·L^-1引物（GmActin11 F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL和G2/ZH10P2 0.6 μL）,ddH₂O补足25 μL。多重PCR扩增最适程序为95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,68℃ 1 min 20 s,35个循环;72℃ 12 min。该多重PCR体系灵敏度为0.5%,符合欧盟有关转基因产品标识的要求。该多重PCR方法特异性很强,可以成功检测受体中黄10、转基因大豆ZH10-6及ZH10-6不同地理来源的11个衍生品系。【结论】建立的转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系具有高通量、特异性强、操作简便和应用广泛的优点,并且能够快速、准确地检测转基因大豆ZH10-6及其衍生品系。     

亚硫酸氢盐测序法检测小鼠胚胎Oct4启动子区甲基化

应用亚硫酸氢盐测序技术,以昆明小白鼠几种不同时期体内胚为研究对象,对其单拷贝基因Oct4启动子区进行甲基化检测.基因组经低熔点琼脂糖包埋、亚硫酸氢盐修饰后,运用巢式PCR对处理后的DNA进行两轮扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测和单克隆测序进行分析.结果表明,亚硫酸氢盐测序法是一项敏感而有效的DNA甲基化检测手段.     

广西地区仔猪致病性大肠杆菌的菌毛基因多重PCR检测及质粒DNA指纹图谱分析

对广西地区56株仔猪致病性大肠杆菌进行菌毛基因的多重PCR检测及质粒DNA指纹图谱分析。多重PCR检测结果证实该方法可用于各大肠杆菌野生菌株的检测,且适用于仔猪大肠杆菌性腹泻病的快速诊断和流行病学调查。质粒DNA指纹图谱分析发现这56个菌株质粒的获得率为100%,来源相同的菌株具有相同或相似的质粒图谱,来源不同的菌株的质粒图谱一般不同。所有菌株都含有1条大小相同的质粒带,表明广西流行的猪大肠杆菌性腹泻病主要是由携带相同质粒的大肠杆菌引起。试验结果表明,质粒DNA指纹图谱法可作为大肠埃希氏菌分型的分子生物学方法。     

普通荞麦染色体的原位PCR技术研究

[目的]探索一种适合荞麦的简单易行的染色体原位PCR技术。[方法]采用16S套式引物、4.5S套式引物与psbA引物,以栽培甜荞为材料,进行了染色体原位PCR、原位套式PCR与多次原位PCR试验。[结果]高温干燥可以起到与包埋类似的作用;染色体的原位套式PCR效果比原位PCR明显;多次原位PCR次数为5～6效果较佳。16S引物和4.5S引物均显示了4对信号,但位置不同;而psbA引物是单拷贝的,仅显示出1对信号。根据这些信号得位置差异可以区分普通荞麦的5对染色体。[结论]所使用的荞麦染色体原位PCR技术简单易行。