孵育和激活剂作用时间对山羊核移植胚胎早期发育的影响

探讨了电融合前对重构卵继续孵育及激活剂6-DMAP不同作用时间对山羊核移植胚胎体外发育的影响。结果显示,重构卵在成熟液中继续培养后,9~10 h组的融合后卵子死亡率(27.42%)显著低于30 min和90 min组(49.26%和56.3%)(P0.05),胚胎卵裂率(68.15%)则显著高于30 min和90 min组(55.6%和54.24%)(P0.05);重构卵用离子霉素激活后,再用6-DMAP激活0 h、2 h、3 h、4 h、5 h及8~10 h,各组间的胚胎卵裂率均无显著差异(P0.05),但均显著高于未用6-DMAP组的卵裂率(P0.05)。本试验结果表明,电融合前,继续成熟培养重构卵有利于降低电融合时的卵子死亡率,提高卵子利用率;联合使用离子霉素和6-DMAP有利于提高激活效果,而6-DMAP的作用时间(2~10 h)不影响核移植胚胎的卵裂。     

亚硫酸氢盐测序法检测小鼠胚胎Oct4启动子区甲基化

应用亚硫酸氢盐测序技术,以昆明小白鼠几种不同时期体内胚为研究对象,对其单拷贝基因Oct4启动子区进行甲基化检测.基因组经低熔点琼脂糖包埋、亚硫酸氢盐修饰后,运用巢式PCR对处理后的DNA进行两轮扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测和单克隆测序进行分析.结果表明,亚硫酸氢盐测序法是一项敏感而有效的DNA甲基化检测手段.     

BMP4在诱导骨髓间充质干细胞向生殖细胞分化中的作用

为了探讨骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)在诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向生殖细胞分化中的作用,将全骨髓培养法获取小鼠BMSCs,在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养液中培养传代;取生长状态良好的第三代(P3)BMSCs,分别添加不同浓度(5、10、20、40和80ng·mL~(-1))的BMP4作为实验组,未添加BMP4为对照组。4d后,MTT法和台盼蓝染色检测细胞的增殖率和存活率,实时定量PCR(RT-qPCR)检测生殖细胞阶段特异性基因(Oct4、Dazl、Fragilis、Mvh、Nobox、Stella、Stra8和Gdf9)的表达。结果发现,BMP4浓度为5~20 ng·mL~(-1)时细胞存活率和增殖率最高;BMP4浓度为20 ng·mL~(-1)组Mvh、Fragilis、Oct-4、Dazl及Stella表达水平最高,均显著高于对照组(P0.05);Nobox表达水平则在BMP4浓度40ng·mL~(-1)组最高,且各浓度组均显著高于对照组(P0.05);各浓度BMP4组Stra8和Gdf9的表达水平均与对照组间无显著性差异(P0.05)。此结果提示,BMP4浓度在20 ng·mL~(-1)时,BMSCs的存活率、增殖率及原始生殖细胞特异性基因的表达最高;BMP4在诱导间充质干细胞向生殖细胞分化过程中起重要作用。     

改良培养基对体外培养生精细胞增殖分化的影响

探讨改良培养基对体外培养小鼠生精细胞的增殖分化效应。根据培养基的不同分为:A组(基础培养液组);B组[基础培养液+胶质细胞神经营养因子(GDNF)+表皮生长因子(EGF)组];C1、C2和C3组[A组+20%、40%、80%睾丸液(TA)];D1、D2和D3组(B组+20%、40%、80%TA)。采用上述8种培养基对7~8日龄小鼠生精细胞进行体外培养,通过细胞形态学观察、细胞存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析,探讨TA、GDNF和EGF对小鼠体外培养生精细胞的增殖分化效应,结果如下:(1)形态学观察表明,B组生精细胞生长速度快,形态好,细胞集落多,A组最差;C组和D组细胞传代后培养时间最长,可达4个月。(2)生精细胞存活率结果显示,培养20 d的B组细胞存活率显著高于其他各组(P0.05),C、D组在各培养阶段与A组间无显著性差异。(3)TP1/P19培养15 d后B组的TP1/P19显著高于其他各组(P0.05),其他各组间均无显著性差异。(4)单倍体精子细胞比例结果表明,培养15 d后的B组单倍体细胞比例显著高于其他各组(P0.05),其他各组间单倍体细胞比例均无显著性差异。GDNF和EGF可显著提高生精细胞体外培养的增殖分化效应,而睾丸液可显著延长生精细胞体外培养时间。     

促性腺激素释放激素类似肽主动免疫对公猪生殖机能的影响

10头公猪在3月龄时用促性腺激素并列体二聚体(GnRHTD)主动免疫,观测内源GnRH被免疫中和所产生的内分泌和生殖机能的变化。注射GnRHTD与卵清蛋白(OVA)的偶联物2次,结果发现GnRHTD主动免疫能降低外周血清睾酮浓度,睾丸重量也明显下降。组织切片显示,曲细精管有少数退化的精原细胞。这些变化表明:公猪接种GnRHTDOVA能诱发免疫反应,中和内源GnRH的生物活性,且抑制睾酮的合成,从而导致性器官发育受阻。     

山羊（Bore）-兔异种克隆胚胎连续核移植的研究

 以山羊-兔异种克隆桑椹胚卵裂球为核供体，兔卵母细胞为受体进行连续核移植研究，最终连续2次，共获得继Ⅰ代重构胚58枚，继Ⅱ代重构胚14枚。融合率分别为79.5%和70%，差异不显著（P>0.05）卵裂率分别为75.9%和28.6%,差异显著（P<0.05）。但继Ⅱ代重构胚最终未能发育至囊胚，继Ⅰ代重构胚囊胚率达到10.2%。     

不同因素对牛-兔种间重构卵融合率的影响*

研究了用不同方法处理的核供体细胞(休眠期和非休眠期的体细胞、4℃冷藏1～5 d或12～14 d的体细胞)、融合液中加入细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)以及卵供体兔龄等因素对牛-兔种间重构卵融合率的影响.结果发现,以休眠期或非休眠期的体细胞作核供体,其融合率和在融合过程中的死卵率均无显著差异(P＞0.05);将核供体细胞(休眠期或非休眠期的体细胞)在4℃冷藏1～5 d或12～14 d,与新鲜的核供体细胞相比,对重构卵的融合率和在融合过程中的死卵率无显著影响(P＞0.05);在融合液中加入CB后对融合率无明显影响(P＞0.05),但在融合过程中死卵率显著升高(P＜0.05);用青年兔(3～5月龄)的卵母细胞作受体与用经产兔(10～12月龄)的相比,其融合率无显著差异(P＞0.05),但在融合过程中,用青年兔卵母细胞作受体的重组卵的死卵率极显著低于用经产兔卵作受体的重组卵(P＜0.01).     

牛-兔种间重组胚体外发育能力的研究

 以超排的青年母兔和经产母兔卵母细胞为受体细胞,以处于休眠期和非休眠期的黑毛和牛耳成纤维细胞为核供体,共获得180枚种间重组胚,采用M199+10%FBS和RD+10%FBS2种培养液进行体外培养,有112枚发育到2-细胞期(62.2%),26枚发育到桑椹胚期(14.4%),20枚发育到囊胚期(11.1%)。结果显示,供体细胞处于休眠期与否,对重组胚的卵裂率无显著影响(P<0.05),但以休眠期细胞为核供体的重组胚8-细胞～16-细胞胚的发育率及桑椹胚发育率显著高于非休眠期细胞的重组胚(P<0.05),二者在     

波尔-黄淮白山羊体细胞核移植重构胚电融合参数的选择

以波尔山羊耳成纤维细胞为核供体细胞,黄淮白山羊卵母细胞为受体进行核移植,对重构卵进行电融合处理,发现电融合参数为250 V·mm-1、1次电脉冲时,40μs组的卵裂率显著高于10 μs组和20μs组(P＜0.05),但10μs组融合后的存活率最高(P＜0.05).当融合参数为250 V·mm-1、10μs时,2次电脉冲组的卵裂率显著高于1次电脉冲组(P＜0.05),但1次电脉冲组的融合后存活率和胚胎获得率均高于2次脉冲组(P＜0.05).综合试验结果认为,适宜的山羊体细胞核移植的电融合参数是250 V·mm-1、10μs、1次电脉冲.