河北省奶牛牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离鉴定

从河北省某规模化奶牛场牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)疑似病例中采集病料,将处理好的病料接种MDBK细胞,盲传9代,得到了不产生细胞病变的病毒。琼脂扩散试验表明本病毒能与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)OregonC24标准阳性血清反应,出现沉淀线;细胞培养物用BVD/MD荧光抗体染色检测,可见到荧光着染的特异性细胞,荧光颗粒出现于胞浆中。双抗体夹心ELISA检测病毒抗原结果BVDVOregonC24VP/N为3.141,分离毒P/N为3.012,P/N>2,与BVDVOregonC24V结果一致;电镜观察到圆形、直径为40～60nm,有囊膜,囊膜表面有突起的病毒粒子,与BVDV颗粒基本一致。经RT-CR检测,扩增出了唯一的315bp的目的条带,进一步证实为牛病毒性腹泻/粘膜病病毒。     

牛白血病的诊断和防治

牛白血病又称牛病毒性造血细胞组织增生症、牛淋巴肉瘤、牛恶性淋巴瘤、牛白血病复合征等。本病是由病毒引起的一种淋巴网状系统全身性恶性肿瘤。它是由淋巴组织的一种或多种白细胞成分的恶性增生后进入血液中,使白细胞异常增多,导致以恶病质和高病死率为特征。1病原为牛白血病病毒。根据本病病原的不同,分为地方流行型白血病和散发型白血病两大类。牛地方流行型白血病病毒呈C型病毒粒子,其直径为90～120nm,核心直径60～90nm,呈圆形或椭圆形。成熟病毒粒子在细胞膜上以出芽方式释放。牛白血病病毒对外界环境的抵抗力较强,加热60℃以上,可使…     

禽腺病毒的分离鉴定及LMH细胞适应毒的生物学特性研究

为了对采集自北京平谷某养殖场发病鸡中出现心包积液综合征症状的病料进行病毒分离和鉴定,将病料接种LMH细胞进行病毒分离,并在LMH上连续传代,取C5和C15代细胞毒分别接种3周龄SPF鸡进行致病性试验。根据分离病毒在LMH上的CPE特征、病毒血清中和试验、Hexon基因序列比对分析、SPF鸡致病性回归试验,表明从发病鸡病料中分离的一株病毒为血清4型禽腺病毒;病毒在LMH细胞盲传3代后,就能很好地适应细胞培养,出现禽腺病毒典型的CPE;培养至第10代,病毒在接种后72 h,病毒含量即可达到107.4TCID50/0.1m L的峰值滴度;接种细胞毒的SPF鸡出现4型禽腺病毒导致的典型临床症状和特异性剖检病理变化,两组接种鸡的死亡率分别为100%和70%。结果表明,研究分离到的4型禽腺病毒毒株对SPF鸡具有高致死率,但病毒经过细胞连续传代后对鸡的致死率降低。     

禽白血病病毒分离鉴定

使用 SPF鸡胚成纤维细胞从蛋用种鸡的病料中分离到一株病毒.经禽白血病病毒（ALV） p-27抗原ELISA检测、病毒培养、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）鉴定、群特异性抗血清中和试验和动物回归试验等证明,该株病毒属于禽白血病病毒.     

绵羊进行性肺炎病对山羊的感染试验

绵羊进行性肺炎病毒（ＯＰＰＶ）感染山羊可生产琼扩抗体，用ＯＰＰ抗体阳性山羊的肺脏、肝脏分离物在绵羊胎肺细胞上连续培养传代。可出现以多核巨细胞为特征为细胞病变。用其培养物制备的琼扩抗原与抗ＯＰＰＶ标准阳性血清呈阳性反应，与抗马传贫病毒、牛白血病病毒标准阳性血清无交叉反应，电镜观察，病毒粒子大多散在细胞外及胞浆空胞中，以出芽方式增殖，病毒呈球多，直径８０～１２０ｎｍ，用ＯＰＰＶ感染山羊的肝脏分离培养物     

复制C型白血病病毒细胞培养物的获得

近年来,出现了关于从患不同形式血组织增生病的牛发现并分离出C型白血病病毒的报道,C型白血病病毒的生物学特性同已知的鸡、猫的白血病病毒相似。因为C型白血病病毒是外源性致瘤的溯源病毒,一些学者认为,当血组织增生时该病毒起着病原学作用。但是目前尚需进一步证实。在动物体内存在着C型白血病病毒—典型的持久性病毒感染这一事实没有引起怀疑。常常为了模拟这样的感染,首先使用含多型细胞群体的胰酶消化培养物。当一定型的细胞群体对病毒亲合时,要进一步将其选育,则能获得恒定的复制牛白血病病毒的含毒材料,此种含毒材料可用作     

绵羊猝狙的病原分离与鉴定

2000年7－8月，青海省同德县某乡藏系棉羊猝死，经对其中两只症状典型病死着羊病料分离培养，分离到数株疑似魏氏梭菌。通过肠内容物毒素检查、纯培养物毒素测定和毒素中和试验，证实致病力较强的两株为C型魏氏梭菌。毒价测定最小致死量均大于500小白鼠MLD。     

对南漳县羊传染性脓疱病的研究

1987年,湖北省南漳县首次发生羊传染性脓疱病(Contagious Ectnyma.CE)的大面积流行,我们采集病料,分离出CE病毒。在羊体进行了回归试验,出现与自然感染羊相同的典型症状,通过电镜观察找到了典型的传染性脓疱病毒粒子;将病毒在犊牛睾丸细胞上培养成功;交互免疫试验证明HCE细胞弱毒疫苗对该病毒有良好的保护作用,用HCE弱毒疫苗对全县羊只进行大面积预防接种,有效地控制了该病的发生和流行。     

马传贫病毒对驴胎多种组培细胞感染情况的电子显微镜观察

通过对取自驴胎胸腺、真皮、淋巴、肾和肺细胞培养物所接种的马传贫病毒(72代毒和123代毒)的电子显微镜观察.发现这些培养物中均有典型的马传贫病毒粒子,而在相应的对照组中未见到此种颗粒.这些病毒粒子同已往在白细胞培养物中所见到的病毒粒子是一致的.偶而,在细胞质中,空泡内和细胞膜上,还可以见到特殊的长杆形粒子。其长度可达1nm。在感染细胞中同对照组比较,病理变化明显,一般病毒传到第七代就可明显看出这种细胞病理变化.并且随培养细胞代次的增加而病变加剧.从整个细胞看来,细胞趋向空泡化,核萎缩,线粒体肿大,线粒体的部分消失,溶酶体增多,粗面内质网隆起。伴随病毒的感染,细胞内出现有严重的“髓样变”现象。有时由于病毒粒子的大量增殖,造成细胞崩解。     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒分离鉴定及生物学特性研究

为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(BVDV)流行毒株,掌握该毒株的生物学特性,本试验在新疆北疆部分地区采集牛病毒性腹泻—黏膜病(BVD/MD)疑似病例的粪便,通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光抗体检测、免疫电镜观察及血清中和试验5种方法对毒株进行分离和鉴定。对毒株的TCID50测定后,再对毒株分别进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、酸碱度敏感性试验、温度敏感性试验及核酸分型试验等理化特性检测。经RT-PCR诊断,病料在286bp处出现了目的片段。将RT-PCR诊断为阳性的粪便,接种于密度约为80%的单层MDBK细胞出现了细胞病变,盲传5代至出现典型的细胞病变。将F5代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体检测,结果产生了与C24V标准毒株相同的特异性黄绿色荧光。免疫电镜观察到了大量呈球形的BVDV粒子,大小20~40nm。血清中和试验中抗体阳性血清处理组细胞均未出现细胞病变,病毒完全被抗体阳性血清中和。综合以上方法确定分离株为BVDV毒株。对分离株进行毒价和理化特性测定,该毒株TCID50为10-4.5/0.1mL,对乙醚和氯仿敏感,对胰蛋白酶敏感,耐碱不耐酸,对温度敏感,经54℃1h完全被灭活,属于RNA病毒。本试验成功分离到一株新疆BVDV流行毒株,掌握了该毒株的生物学特性,为今后该病的诊断和防控奠定了基础。     

猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定

从临床表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）淋巴组织病料，经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪圆环病毒2型（PCV2）感染，采用无污染的猪肾细胞系（PK15）分离培养，并连续传代培育成一株细胞培养适应毒，命名为PCV2／LG株。分离毒株经细胞培养，于第25代后毒价显著升高，于第35代毒价可达10^5.6TCID 50/mL。采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）、免疫电镜技术、分子克隆及核酸序列分析等鉴定表明，分离株感染细胞后病毒抗原主要分布在细胞核及细胞质中；病毒感染的阳性细胞呈散在分布，阳性细胞数可达50％以上；免疫电镜观察到与PCV2特异抗体结合形成的病毒免疫复合物呈实心小颗粒样粒子团，病毒粒子直径约为17nm；病毒抗原基因组由1768个核苷酸组成，与GenBank登录的8个PCV2基因组序列同源性达96．2％以上。用2mL的病毒细胞培养物（10^5.6TCID 50/mL）接种30日龄PCV2抗体阴性仔猪3头，可引起典型PMWS临床症状。本研究为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究奠定了基础。     

牛白细胞增生病的自然传播和控制原则

通过近10年来的研究,已能鉴定牛白细胞增生病病毒(BLV),并能描述其特征。这种病毒具有与其它动物的白血病有关的C型病毒所具有的若干形态、生化和生物学特征。根据在有典型病例牛群所做     

致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中，经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒感染，采用无PCV1污染的猪肾细胞系（PK-15）分离培养，经蚀斑克隆纯化，培育1株细胞培养适应毒，命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代，能够产生典型的细胞病变，病毒滴度随代次显著增加，第24代毒价达10^8.5 TCID50／mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观，无囊膜的病毒粒子直径约110nm～150nm，有囊膜的成熟病毒粒子直径约150nm～180nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因，其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7％～100％。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24h～72h内全部死亡。研究表明，PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性，为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒分离鉴定及生物学特性研究

为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)流行毒株,掌握该毒株的生物学特性,本试验在新疆北疆部分地区采集牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD/MD)疑似病例的粪便,通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光抗体检测、免疫电镜观察及血清中和试验5种方法对毒株进行分离和鉴定。对毒株的TCID₅₀测定后,再对毒株分别进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、酸碱度敏感性试验、温度敏感性试验及核酸分型试验等理化特性检测。经RT-PCR诊断,病料在286 bp处出现了目的片段。将RT-PCR诊断为阳性的粪便,接种于密度约为80%的单层MDBK细胞出现了细胞病变,盲传5代至出现典型的细胞病变。将F5代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体检测,结果产生了与C₂₄V标准毒株相同的特异性黄绿色荧光。免疫电镜观察到了大量呈球形的BVDV粒子,大小20~40 nm。血清中和试验中抗体阳性血清处理组细胞均未出现细胞病变,病毒完全被抗体阳性血清中和。综合以上方法确定分离株为BVDV毒株。对分离株进行毒价和理化特性测定,该毒株TCID₅₀为10^-4.5/0.1 mL,对乙醚和氯仿敏感,对胰蛋白酶敏感,耐碱不耐酸,对温度敏感,经54 ℃ 1 h完全被灭活,属于RNA病毒。本试验成功分离到一株新疆BVDV流行毒株,掌握了该毒株的生物学特性,为今后该病的诊断和防控奠定了基础。     

山羊痘病毒的分离与鉴定

对贵州省2002年以来发生的疑似山羊痘病例样品进行了病毒的分离与鉴定。取山羊痘病羊的皮肤痘疹和水疱作待检病料,接种BHK-21传代细胞盲传3代后,出现了明显的、规律的细胞病变(CPE),病毒细胞培养物在F4代以后,能与山羊痘标准阳性血清在琼脂扩散试验中出现白色沉淀线,而与正常细胞的培养物及PBS不出现沉淀线;参照GenBank上山羊痘病毒P32基因序列,设计了1对特异性引物,对现场分离毒株进行PCR扩增,可扩增出963bp特异性的DNA条带。用待检病料感染的BHK-21细胞培养物接种9日龄鸡胚绒毛尿囊膜,随着传代次数的增加,痘斑病变的出现率从13.3%～20%上升至33.3%～40%;用山羊痘病变皮肤、鸡胚绒毛尿囊膜和感染细胞进行超薄切片,在电子显微镜下可以观察到典型的山羊痘病毒粒子。     

湖北省羊口疮病毒的分离鉴定

利用MDBK传代细胞系对湖北通山县某羊场疑似羊口疮(Orf)的黑山羊病料进行分离,通过病毒理化特性试验、动物回归试验和PCR等方法对分离的毒株进行鉴定。结果表明,病料悬液接种MDBK细胞后出现细胞病变,接种病料的羊只出现典型的Orf症状,扩增出羊口疮病毒(Orf virus)B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106.1、DQ904351.1)相似性最高(均为99%),亲缘关系最近。本研究成功分离鉴定到一株ORFV,命名为ORFV/HB/09。     

羊口疮病毒大足株的分离鉴定

本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒（orf virus，ORFV）流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料，提取病料DNA，经PCR鉴定为ORFV阳性；将阳性病料做常规处理，接种羔羊睾丸细胞（LT），并盲传至5代，观察接毒LT细胞病变，将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验（IFA）、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID₅₀测定。结果显示，经PCR检测，18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%（11/18）；大足株病料接种LT细胞36 h后，长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩，72 h后大部分细胞脱落；间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光，且荧光绕核分布；F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带，大小为1 137 bp；将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对，其核苷酸同源性在97.9%~100%之间，与美国SA00分离株同源性达100%，且遗传进化分析显示处于同一进化分支，亲缘关系较近；测定F5代细胞培养物TCID₅₀值为10^-5.68/0.1 mL，在细胞中能稳定增殖。综上所述，本研究成功分离并获得1株ORFV，为后续ORFV研究提供了生物材料，同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。     

河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定

从河南省不同地区规模化肉牛场牛病毒性腹泻(BVD)疑似病例中采集病料,将处理好的6份病料接种MDBK细胞,并盲传4代,得到了两株可产生细胞病变的病毒,经测定该两株病毒的TCID50分别为10-6.59/0.1ml和10-6.51/0.1ml;琼脂扩散试验表明该两株病毒均能与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)OregonC24标准阳性血清反应,出现沉淀线,且均能被BVDV标准阳性血清中和;电镜观察到圆形、有囊膜、直径为40～60nm、囊膜表面有突起的病毒粒子,与BVDV颗粒基本一致。动物回归试验表明,用两株分离毒攻毒的2头3月龄犊牛均出现了和BVD自然病例相似的临床症状,并检测其抗原和抗体,结果均为阳性,从而确定分离的两株病毒均为BVDV,分别将其命名为HN-1和HN-2株。     

基因2型牛病毒性腹泻病毒新疆及山东分离株的鉴定

将疑似为基因2型牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus genotyp02,BVDV-2)感染阳性的不同地区源病料样品接种马-达氏牛肾细胞(Mardin-Darby bovine Kidney,MDBK)单层细胞,进行病毒分离培养和传代.通过BVDV-2型特异性RT-PCR检测结果表明,共分离到2株细胞源BVDV-2病毒,命名为XJ-04和SD-06分离株.间接免疫荧光试验表明,上述分离的细胞源BVDV-2病毒能被鼠源BVDV-2重组E2蛋白抗血清或鼠抗BVDV-2单克隆抗体特异性识别,产生特异性胞内荧光.XJ-04和SD-06分离株分别盲传至13代和8代,光镜下观察到病毒感染的MDBK细胞内空泡化、细胞脱落、呈现拉网状的典型细胞病变.2株细胞源BVDV-2病毒感染的MDBK细胞制备超薄切片,在透射电镜下,细胞内质网中观察到约60 nm大小的病毒粒子.经差速离心、20%蔗糖垫底超速离心提纯的病毒粒子,经磷钨酸染色,负染电镜下观察到病毒有囊膜、粒子大小约60 nm的病毒颗粒.     

徐州地区牛流行热病毒的分离与鉴定

1991年夏秋之交徐州市各奶牛场暴发牛流行热。为确诊该病,采集了发病高热期抗凝血,进行了病毒分离和鉴定试验。病料经处理后,直接接种于BHK_21细胞,传至第二代可见典型的CPE。电镜下观察到80—150nm弹状病毒颗粒。分离毒的理化特性、核酸类型及中和试验结果均与标准BEFV相一致,证实该分离病毒为牛流行热病毒。