水稻浆片颖壳化突变体(gll)的鉴定和精细定位

【目的】鉴定和克隆水稻花器官突变体新基因,对了解水稻花器官发育的分子遗传机理和分子信号调控途径有着重要的作用。【方法】采用田间种植鉴定、突变体和野生型的花器官对比、杂交后代的表型分离统计及基于图位克隆法的基因定位等方法,对自然突变产生的突变体gll的表现型、遗传和基因精细图位开展研究。【结果】表型鉴定认为gll突变体小穗上的颖花变异主要表现为浆片颖壳化和外颖增加。通过杂交F1、F2及F3的表型分离个体χ2测验结果表明,该突变体表型分离符合1对隐性核基因的比例。配制突变体和日本晴的杂交种及其F2分离群体,在F2和F3群体中获得gll表型株作为基因定位群体。利用均匀分布于水稻12条染色体上的156对多态性分子标记,检测gll定位群体中的408株突变体表型个体,将GLL定位于水稻第1染色体上SSR标记RM1068和RM3482之间,遗传距离分别为4.6和2.3 cM。随后检测了4个新的SSR标记,进一步将GLL定位在108 kb的物理距离之内。【结论】水稻gll突变体的性状由1对隐性核基因控制,该基因位于第1染色体长臂的近下端SSR标记RM6097和RM6827之间108 kb范围内。     

水稻花器官数目异常突变体afon1的表型分析与基因定位

【目的】研究水稻花器官数目异常突变体afon1(abnormal floral organ number1)的分子机理,鉴定出控制水稻花器官数目变化的基因。【方法】利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种浙农34获得一个花器官数目异常突变体作为试验材料,命名为afon1。开花期随机取突变体afon1和野生型浙农34的稻穗各5个,利用组织学和扫描电子显微镜等技术研究afon1的花器官表型、细胞学特征和花粉育性。成熟期随机取突变体afon1和野生型浙农34植株各10株,测定株高、分蘖数、穗长、每穗颖花数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状。随机取突变体afon1和野生型饱满种子各100粒,测定发芽势和发芽率。以突变体afon1为母本,分别与野生型浙农34和粳稻品种浙农大104杂交构建2个F2群体进行遗传分析和基因定位,筛选候选基因进行DNA测序比对,构建AFON1蛋白质的空间模型并对其结构进行分析,同时对候选基因以及与花器官数目相关的基因进行实时荧光定量PCR分析。【结果】与野生型相比,突变体afon1中59.64%小穗的花器官数目发生异常,其中多数小穗仅在内稃一侧产生一个颖壳状的器官,部分小穗表现2—4轮花器官数目同时增加;株高和千粒重显著增加,而结实率显著降低。遗传分析表明,突变体afon1与野生型浙农34杂交的F1植株小穗花器官数目表现正常,F2群体中小穗花器官数目正常植株与花器官数目异常植株的分离比符合3﹕1,表明突变体afon1性状受一对隐性核基因控制,基因位于水稻第1染色体长臂端In Del标记1M5和1M18之间,物理距离为73 kb,该区间内共有6个注释基因。突变体afon1和野生型的测序比对发现,突变体afon1中的基因LOC_Os01g67430外显子中第565个碱基T突变成A,导致第189个氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。蛋白质序列和空间结构分析表明,AFON1蛋白质序列中含有一个Lipase_3结构域,结构域内的突变导致蛋白质的空间结构发生了明显的变化。实时荧光定量PCR结果显示,LOC_Os01g67430在突变体afon1幼穗中的表达量要显著高于野生型,而在根、茎和叶中则无显著差异;穗发育早期FON1和FON2/4等调控花器官数目的基因在突变体afon1花器官中的表达量显著增加。【结论】LOC_Os01g67430为突变基因afon1,该基因通过影响花器官数目相关基因的表达而调控各轮花器官数目。     

水稻矮化并花发育异常突变体dwarf and deformed flower 2 (ddf2)的基因定位与候选基因分析

【目的】对一个同时导致营养和生殖器官发育异常的水稻突变体进行表型鉴定、基因定位和候选基因分析,为下一步的基因克隆与功能分析奠定基础。【方法】在水稻籼型恢复系602组织培养后代中,发现一个矮化并花发育异常突变体dwarf and deformed flower 2（ddf2）。抽穗期,以野生型为对照,对ddf2株高、主穗长、节间和功能叶的长宽等性状进行统计分析;同时利用冷冻切片等技术对茎、叶和花器官进行详细的形态和组织学分析。分别以西农1A和中花11为母本,以DDF2/ddf2杂合株系为父本构建2个F₂群体进行遗传分析和基因定位,并对候选基因进行实时荧光定量PCR（real-time PCR）分析。【结果】相较于野生型,突变体各节间的长和茎粗均极显著降低,叶片极显著变短、变窄,同时花序也极显著变短。组织细胞学分析发现,突变体大叶脉数目和相邻2个大叶脉之间的小叶脉数都没有明显的变化,但相邻2个大叶脉之间的宽度明显减小,进一步比较2个小叶脉之间的叶肉细胞,发现在突变体中细胞数目和尺寸均显著降低;突变体茎秆维管束的数目与野生型相比没有明显的变化,但统计发现2个大维管束之间基本组织细胞的数量和细胞的大小都显著小于野生型,表明ddf2突变体茎、叶细胞分裂和膨胀都受到了抑制;此外,ddf2突变体的花器官特征发育受到了严重干扰：第一轮外稃顶部弯曲、内稃不同程度退化,第三轮雄蕊器官严重退化,部分甚至转化为雌蕊状器官,另外部分ddf2小穗的护颖过度发育,转变成稃片状,一些小穗还表现分生组织确定性的丢失,发育出2个以上的小花。遗传分析表明该突变性状受1对隐性基因控制。利用中花11/ddf2的1 024株F₂分离群体,最终将DDF2精细定位在第11染色体短臂近着丝粒位置处,位于insertion/deletion（in/del）标记S-11和S-14之间,遗传距离分别为0.049和0.098 cM,物理距离为90.295 kb,并与标记S-24共分离。分析定位区间的基因,发现共有MSU注释基因12个,其中一个编码Sec3_C蛋白的LOC_Os11g17600内部包含共分离标记S-24,进一步对该基因进行表达分析,发现该基因在突变体的叶、茎和穗中都表现出明显的下调,初步将LOC_Os11g17600作为DDF2候选基因。【结论】DDF2是一个同时控制水稻茎/叶和花器官发育的新基因。     

水稻开颖半不育突变体的观察、遗传分析和基因定位

【目的】通过对一份航天诱变水稻（Oryza sativa L.）开颖半不育突变体ohss（open-hull semi-sterility）进行形态特性调查、遗传分析和基因定位,筛选候选基因,为下一步基因克隆和功能分析奠定基础。【方法】以籼稻品种航恢七号为材料,通过“神舟八号”飞船搭载,诱变获得一份水稻开颖半不育突变体ohss。对其进行形态特征解剖观察,分析颖花器官发育突变特点。调查突变体和野生型的花粉可育率、自然结实率和套袋自交结实率,对其育性进行鉴定。随机选取5个成熟单株,考察穗部谷粒相关性状并进行统计分析。通过覆盖全基因组的SSR分子标记检测,解析空间诱变的分子变异效应。以航恢七号、Francis和02428与突变体ohss配制杂交组合,观察F₁和F₂植株的花器官表型,进行?²测验,对突变性状进行遗传分析。以02428/ohss的F₂分离群体作为目标基因定位群体,同时利用SSR标记以及新开发的多个InDel分子标记开展基因定位研究。利用RAP水稻基因组注释数据库对定位区间的候选基因进行预测,通过序列比对和基因表达分析筛选候选基因。【结果】开颖半不育花器官突变体ohss与野生型相比,抽穗期穗部明显包茎,颖花发育出现异常,内外稃片瘪弱、扭曲变形且开裂不抱合,颖花内部发育类似内稃状的器官,部分颖花没有内稃的分化。ohss发育异常颖花中可育花粉率58.74%,导致单株结实率、穗重、穗实粒数与野生型相比极显著降低。全基因组SSR标记检测表明突变体ohss总变异频率为0.0336,除了第7、12染色体未检测到突变位点,其他染色体上检测到突变频率范围为0.0143-0.0889。遗传分析结果显示ohss的开颖半不育表型受单隐性核基因ohss(t)控制,并将ohss(t)定位在水稻第3染色体上2个InDel标记InDel6043和InDel6070之间约27.6 kb的物理距离内。该区域有3个预测注释基因,序列比对和表达分析表明突变体ohss的OsMADS1编码区及启动子序列未发生突变,但是表达模式发生强烈改变。【结论】开颖半不育的花器官发育突变体ohss受单隐性核基因ohss(t)控制,ohss(t)定位在水稻第3染色体上InDel6043和InDel6070标记之间约27.6 kb的物理距离内,其OsMADS1的编码序列及5′UTR区未发生碱基突变但表达受到强烈抑制。     

水稻颖花开放前花器官茉莉酸水平变化及浆片茉莉酸信号基因表达分析

【目的】水稻颖花开放是由浆片膨大所启动的,并与花丝伸长和花药开裂同步发生。脂类衍生的茉莉酸（JA）激素在植物生殖发育中发挥重要调控作用。本文分析水稻颖花开放过程中花器官JA水平及浆片JA信号基因表达的动态变化,以进一步揭示内源JA信号在水稻颖花开放中的作用。【方法】以粳稻中花11颖花自然开放前18 h（18 h BF）和临近开放时0 h（0 h BF）的颖花器官（小穗梗、内外稃、浆片、雄蕊、雌蕊）为试验材料。100 mg液氮研磨的样品经甲醇﹕水﹕乙酸（80﹕19﹕1,体积比）混合液提取、氮气浓缩和0.22 μm滤膜过滤后,直接应用超高速液相色谱-电喷雾-质谱系统（UFLC-ESI-MS）测定JA含量。Trizol试剂提取水稻总RNA,DNaseⅠ消化残存的基因组DNA,M-MLV逆转录酶合成第一链cDNAs。JA生物合成和信号转导相关基因的表达分析采用SYBR Green实时定量 PCR技术,以水稻GAPDH作内参。试验设置2次生物学重复,差异显著性分析采用t测验。【结果】水稻颖花开放前18 h,花器官中小穗梗JA水平（16.0 ng·g^-1 FW）最高,内外稃次之（6.1 ng·g^-1 FW）,雄蕊、浆片和雌蕊极低（小于4.0 ng·g^-1 FW）。颖花开放时,小穗梗JA水平下降了69%,内外稃升高了71%,雌蕊、雄蕊和浆片JA水平分别上升至19.0、77.2和52.4 ng·g^-1 FW。颖花开放时雄蕊和浆片的JA水平显著高于其他花器官,而小穗梗JA含量最低。与JA水平变化相一致,颖花开放时JA生物合成相关基因OsDAD1、OsAOS1、OsAOC及OsOPR7在雄蕊和浆片中的表达大幅上升,在内外稃中略有上升,而在小穗梗中的表达明显下调。但是,颖花开放时这些JA生物合成相关基因在雌蕊中的表达不上调,与JA水平变化不一致。OsLOX2和OsAOS2在小穗梗和内外稃中的表达水平较高,而在浆片、雄蕊、雌蕊中的表达水平极低。伴随颖花开放时浆片JA水平的大幅上升,浆片JA信号转导途径相关基因OsJAR1、OsCOI1b以及13个OsJAZs的表达也明显上调。其中,OsJAZ11的表达水平上升幅度最大,升高了近520倍。然而, OsJAR2、OsCOI1a、OsCOI2、OsJAZ5和OsJAZ15在浆片中的表达没有上调。【结论】内源JA在水稻颖花器官中的分布具有组织和发育时期特异性。结合外源JA对水稻颖花开放的灵敏诱导,颖花开放时浆片JA的积累以及JA生物合成和信号转导途径相关基因的差异性激活,强烈表明内源JA信号介导水稻浆片膨大的调控。     

小麦赤霉菌绿色荧光蛋白标记突变体的侵染研究

 【目的】赤霉病是危害大麦、小麦生产的世界性病害,研究病原菌的致病过程对于病害的控制有重要意义。【方法】本研究利用绿色荧光蛋白（GFP）标记的禾谷镰刀菌回复突变体以单花滴注方法进行人工接种研究不同突变体的致病力差异及其在小麦穗部的侵染过程。【结果】269株回复突变体的致病力存在明显分化。接种6 d后,致病力明显降低的突变体,只有接种小穗发病,致病力明显增强的突变体,病症可扩展至5个小穗。GFP荧光信号检测表明,弱致病突变体在接种后仅在接种小穗内生长、延伸,并终止于小穗基部的致密组织处。而强致病力突变体在接种小穗内生长2 d后,即能够通过小穗基部的致密组织到达小麦穗轴,并沿着穗轴内部微管束组织和皮层组织向上和下延伸,侵入邻近小穗。【结论】病原菌在接种小穗中生长后,沿着柱头、子房或内、外稃内表面,经过靠近穗轴的致密组织,侵入邻近小穗,感染整个麦穗,直至到达茎秆。     

水稻花器官突变体lfl(leafy lodicules)的鉴定与分析

在杂交育种中发现的一个水稻花器官突变体，经过多代种植，已稳定遗传。以此突变体为父本，以D62A、岗46A、11-32A和金23A为母本配制杂交组合进行遗传分析，根据F2表型及X2测验结果表明，该突变体的性状是由单隐性基因控制的。此突变体除了花器官，其它农艺性状与野生型无异。在同一突变植株中，有正常小花，也有多种花器官突变表型：内颖缺失或弯曲，浆片与异常叶状体相连，雄蕊正常或部分增多退化，部分雌蕊异常、呈双雄蕊或三拄头。所有突变体中浆片都与叶状体相连，呈浆片叶化表型，因此我们将此突变体命名为水稻浆片叶化突变体lfl（leafy lodieules），形态分析表明￡儿为一个新的水稻花器官发育相关基因。     

水稻长护颖突变体基因的克隆与表达分析

【目的】利用EMS对水稻（Oryza sativa L.）保持系品种宜香1B进行诱变,筛选出3份长护颖突变体。通过基因定位和克隆,探明控制该性状的遗传基础以及分子机理,并在不同器官进行表达分析,了解该基因表达特点。【方法】以3份水稻长护颖突变体Oslg-1、Oslg-2和Oslg-3为材料,进行表型分析、等位性鉴定、基因定位、生物信息学分析,以及qRT-PCR定量表达分析。【结果】Oslg-1突变体小穗在幼穗发育早期与野生型无明显差异,但在成熟期其护颖的远轴表皮细胞凸起且粗糙,形成的结节轴向对齐排列,且毛状物较多,形成垂直相间的横纵沟,与外稃表皮细胞结构相似。遗传分析表明,该类突变表型受1对隐性基因控制,OsLG定位于第7染色体短臂SSR标记RM5344和RM20934之间,遗传距离分别为1.11和0.82 cM,物理距离为246.3 kb。对该区域候选基因分析和测序,发现LOC_Os07g04670基因在编码区第182位碱基（T→A）改变,导致其编码氨基酸第61位（Leu→His）的改变。等位性分析表明,Oslg-2、Oslg-3与Oslg-1属等位变异,进而对突变体Oslg-2和Oslg-3的OsLG测序,突变分别发生在第316位（T→A）和119位（T→C）碱基,导致其编码的氨基酸第106位（Trp→Arg）和第40位（Leu→Pro）突变。对该基因进行同源进化分析和序列比对,表明该基因可能调控水稻护颖伸长。对本突变材料的候选基因和另一控制护颖性状的PAP2进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析,结果表明,OsLG在水稻的叶片、穗、叶鞘和根中均有表达,且在穗部表达最高,而PAP2在除穗部以外的其他部位几乎不表达,表明2个控制护颖性状的基因均具有组织特异性,且PAP2的特异性更强;在长护颖突变体中,2个基因表达量均下调,表明其具有协同表达特点。【结论】3份水稻长护颖突变体OsLG与已报道的G1为同一基因,其功能结构域内氨基酸的突变导致长护颖发育;OsLG和PAP2在穗部具有协同表达的特点。     

水稻PcG类基因 OsEMF2b T-DNA插入杂合突变体的细胞学研究

采用石蜡切片法对水稻OsEMF2b的T-DNA插入杂合突变体的花器官形态、雌雄蕊发育和种子形成等过程进行了细胞学研究。结果表明,OsEMF2b杂合突变体花器官形态和各部分的数量有变异,但花药和胚珠发育以及花粉和胚囊的育性正常。OsEMF2b杂合突变体出现一定比例的受精卵不分裂、胚胎发育延迟、胚胎畸形,胚乳游离核不能细胞化和胚乳细胞退化解体等异常现象,从而导致其结实率明显低于野生型。OsEMF2b基因可能在水稻的花器官形成和种子发育过程中具有重要的调控作用。     

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得高直链淀粉水稻种质

【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术遗传改良水稻种质,创制高直链淀粉新材料。【方法】以水稻品种中花11为试验材料,利用CRISPR/Cas9编辑系统对水稻淀粉分支酶（Starch branching enzymes, SBE）基因OsSBE3进行靶向编辑,利用PCR技术鉴定无标记纯合突变体,并测定其淀粉含量。【结果】T0代获得10株突变体株系,T1代获得5个无标记纯合突变株系,其中4个株系（sbe3-22-6、sbe3-25-3、sbe3-25-4、sbe3-25-6）的直链淀粉含量和淀粉直支比显著高于野生型。【结论】本研究创制了高直链淀粉含量的水稻新种质,为水稻品质改良提供了参考。     

水稻穗顶端退化突变体paa21的表型分析及基因克隆

【目的】水稻穗顶端退化严重影响产量,鉴定与克隆水稻穗顶端退化相关基因,可以丰富水稻穗发育调控的分子机理,为水稻高产分子设计育种提供理论基础和基因资源。【方法】从粳稻品种武运粳30号EMS突变体库筛选到一份稳定遗传的穗顶端退化突变体panicle apical abortion 21（paa21）。对退化一次枝梗比例、每穗退化粒数占比、每穗粒数、株高、穗长、单株产量等农艺性状进行统计。使用台盼蓝和伊文思蓝染色检测顶端小穗是否发生程序性细胞死亡。测定WT和paa21不同发育时期幼穗和不同穗部位的H₂O₂含量。paa21分别与籼稻II-32B、9311正反交进行遗传分析。利用paa21与籼稻II-32B杂交构建的F₂群体进行基因定位和克隆。使用SWISS-MODEL网站预测野生型和突变体蛋白的三维结构。利用RT-qPCR分析ROS响应标志基因、程序性细胞死亡相关基因、过氧化氢酶相关基因的表达量。【结果】paa21突变体发生严重的穗顶端退化,统计paa21所有一次枝梗退化情况,发现退化小穗主要位于顶端的一次枝梗上。与WT相比,paa21的株高、每穗粒数、穗长和单株产量均降低。通过观察不同发育时期的幼穗,发现在paa21突变体幼穗发育至12 cm时,可见穗顶端退化表型。台盼蓝和伊文思蓝染色结果表明突变体顶端小穗发生程序性细胞死亡。在退化的paa21顶端小穗中观察到更强烈的DAB染色;H₂O₂含量测定结果表明,与WT相比,paa21穗中积累更高水平的ROS。遗传分析表明paa21突变表型受一对隐性核基因控制。图位克隆结果发现paa21中Os02g0673100第二外显子发生一个C到T的突变,导致丙氨酸突变为缬氨酸。该基因编码一个铝激活的苹果酸转运蛋白ALMT7。突变位点位于第4个跨膜螺旋上。SWISS-MODEL预测结果表明,该突变位点并未对突变体蛋白三维结构造成明显影响。RT-qPCR结果表明,在幼穗发育至10 cm时,paa21中ROS响应标志基因Os01g0826400、Os05g0474800和Os02g0181300,程序性细胞死亡相关基因VPE2和VPE3,过氧化氢酶编码基因CATA、CATB、CATC的表达量较WT大幅升高。此外,paa21 10 cm幼穗中过氧化氢酶（CAT）的活性较WT明显下降。【结论】paa21幼穗在发育后期顶端小穗中积累过量的ROS,产生程序性细胞死亡,最终导致顶端小穗发生退化。     

水稻根系发育基因OsKSR7 的克隆与功能分析

【目的】 水稻根系是与地上部性状和产量密切相关的重要农艺性状。通过鉴定新的水稻根系发育相关基因,为深入解析水稻根系发育遗传机理奠定基础。【方法】 从甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变的水稻Kasalath突变体库中筛选到1个根系发育缺陷的突变体Osksr7 （Oryza sativa kasalath short root 7 ）。通过溶液培养和田间种植,对该突变体进行苗期表型鉴定及成熟期主要农艺性状考察。将Osksr7 分别与野生型籼稻Kasalath和粳稻Nipponbare杂交,F₂群体进行遗传分析和突变基因的图位克隆,对预测的候选基因进行测序验证。构建由35S启动子驱动OsKSR7 的回复载体,通过农杆菌介导转入突变体成熟胚诱导的愈伤组织进行转基因互补验证。【结果】 与野生型相比,Osksr7 幼苗期的主根、不定根、侧根和根毛的伸长都受到抑制,主根、不定根和侧根的长度分别只有野生型的33%、38.9%和35.3%,但不定根数有显著增加。农艺性状调查发现,Osksr7 的株高、穗数、茎秆粗细、结实率、千粒重和剑叶长宽等性状都受到显著影响,其中,穗数和结实率的差异极显著,分别只有野生型的56.3%和37.3%。遗传分析表明,突变体Osksr7 和籼稻Kasalath杂交的F₁表型正常,F₂群体中正常植株与短根突变植株的分离比符合3﹕1,表明突变体Osksr7 的突变性状受1对隐性核基因控制;利用SSR和InDel分子标记将突变基因定位在水稻第11染色体上IND1与IND2之间,物理距离约为143 kb的区间。在该区间有25个预测注释基因,候选基因测序比对发现,突变体Osksr7 中的一个编码转运蛋白的基因LOC_Os11g24560 第一个外显子上ATG后73 bp处的T突变为A,导致编码的第25位氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。生物信息学分析表明LOC_Os11g24560 是介导蛋白质从内质网（ER）运向高尔基体（Golgi）的COPII有被小泡的SEC23亚基在水稻中的同源基因。RT-PCR表明LOC_Os11g24560 的表达水平在野生型和Osksr7 突变体中无显著差异,35S启动子驱动的LOC_Os11g24560 的回复载体能够使Osksr7 突变体的表型回复成野生型,证实Osksr7 的表型是由LOC_Os11g24560 突变引起。【结论】 Osksr7 是一个水稻短根突变体,其产量相关的几个重要农艺性状显著受抑制,突变基因为LOC_Os11g24560 ,编码COPII有被小泡的SEC23亚基,与已报道的水稻根系基因都不等位,是一个新的水稻根系发育调控基因。     

水稻短宽粒基因SWG1的图位克隆

【目的】水稻产量由单位面积有效穗数、每穗粒数和粒重3个因素构成,其中,粒重主要由水稻的籽粒形态决定。筛选和鉴定新的粒型突变材料和基因,可为产量性状的分子设计育种奠定基础。【方法】在籼稻保持系西大1B(XD1B)的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变群体中鉴定到一个短宽粒突变体short and widen grain 1(swg1);分析籽粒形态和其他农艺性状,并对颖壳进行组织细胞学观察分析;运用BSA法进行基因定位;通过遗传互补试验确定候选基因;采用qRT-PCR分析该基因的表达模式及其他粒型相关基因和细胞发育基因的表达水平。【结果】农艺性状分析发现,与野生型相比,swg1突变体粒长显著降低,粒宽显著增加,表现出短宽粒的表型;进一步组织和细胞学分析,发现突变体颖壳纵向细胞变短是粒长变短的主要原因,而粒宽增加是由于颖壳横向细胞数目和细胞大小同时增加。遗传分析结果表明,该突变性状受隐性单基因控制,通过图位克隆与遗传互补验证,确定候选基因为LOC＿Os07g42410,编码一个植物特异转录因子。qRT-PCR分析发现该基因表达无明显的组织特异性,在茎、叶、幼穗中表达强烈。通过对已知粒型相关基因、细胞...     

水稻直立短穗突变体esp的转录组研究

【目的】克隆水稻直立短穗基因Erect and Short Panicle（ESP）,分析其参与的基因调控途径,解析ESP控制株型、穗长等农艺性状的分子机理。【方法】以直立短穗突变体esp及其野生型为材料,成熟期进行株高、穗长、粒长等表型测定;构建籼粳杂交F₂定位群体,挑选与突变表型一致的F₂单株,利用与突变性状连锁的分子标记对目的基因进行定位;对野生型和突变体进行基因组测序,结合定位结果,找到突变位点,克隆ESP;利用生物信息学软件进行进化树和基因表达分析;提取野生型和突变体幼穗中的RNA并建库,GO（gene ontology）聚类分析表达差异基因,同时根据KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库,分析野生型和突变体中植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因的表达变化,并通过qRT-PCR验证。【结果】通过表型观察和农艺性状调查,与野生型相比,直立短穗突变体esp株高降低,穗长变短,穗型由弯曲变为直立,每穗粒数减少,粒长变短,粒宽和千粒重增加;有效穗数无显著差异。利用突变体esp与PA64构建籼粳F₂定位群体,将目的基因定位于水稻第7染色体长臂标记C7-11和C7-14之间7.58 Mb区间内,基因组测序发现LOC_Os07g42410第6内含子与第7外显子连接位点由碱基G变异为A,导致第6内含子不能被剪切,蛋白翻译提前终止;该基因与已报道的OsDEP2/OsEP2为等位基因。进化分析显示该基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中;表达分析表明ESP在茎秆、花序、雌蕊、内外稃和子房中高度表达,其表达水平随着子房变大而逐渐降低。利用转录组分析突变体和野生型幼穗中的基因表达,结果表明,与野生型相比,esp突变体中表达差异显著（差异>1.5倍）的基因630个,其中235个表达上调,395个表达下调。GO分析显示植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因受到不同程度地调控,利用qRT-PCR进行验证,结果与转录组数据一致。【结论】直立短穗基因ESP与已报道的直立穗基因OsDEP2/OsEP2为等位基因,其突变导致株高降低、穗长变短等多个表型;ESP可能通过调节植物激素信号转导、内质网蛋白加工过程中的基因表达,进而影响植株的发育。     

蔗糖转运蛋白OsSUT5在水稻花粉发育及结实中的作用

【目的】蔗糖是植物体内光合产物运输的主要形式。蔗糖-质子同向运输蛋白（sucrose transporter/sucrose carrier,SUT/SUC）在植物细胞之间的蔗糖跨膜运输以及植物组织和器官之间的蔗糖分配中具有重要作用。水稻SUT家族共有5个成员。已有研究表明,敲除OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4对水稻的生长发育产生显著影响,说明这些基因不可替代。然而,OsSUT5的功能还未见报道。阐明OsSUT5在水稻生长发育中的作用,将为全面了解SUT蛋白在模式植物水稻中的生理功能提供新的依据。【方法】通过对水稻OsSUT5的时空表达特性进行实时荧光定量PCR分析,同时利用OsSUT5的推测启动子驱动GUS在水稻体内表达,获得其基因编码蛋白的组织定位信息,以及在烟草叶片表皮细胞内进行OsSUT5-GFP融合蛋白瞬时表达,对蛋白进行亚细胞定位,比较基因编辑技术（CRISPR-Cas9）创制的OsSUT5不同纯合突变株系与野生型对照水稻的形态和生理特征,获得OsSUT5的功能信息。【结果】转录水平上,OsSUT5在水稻茎、叶、花序和颖果中均有表达,并且该基因编码蛋白在营养器官中的表达集中于维管组织。在生殖器官中,OsSUT5的表达主要位于花药及发育的颖果内。该基因编码蛋白在水稻发育的颖果特别是盾片和胚根鞘中高表达。烟草叶片表皮细胞内的瞬时表达显示OsSUT5-GFP融合蛋白定位于细胞质膜。与野生型水稻相比,3个OsSUT5纯合突变株系均表现为花粉活性以及离体萌发率明显降低。与此相吻合的是,OsSUT5突变株系未授粉的小穗比例相对于野生型显著增加,同时突变株系结实率显著下降。通过对OsSUT5突变株系颖果的观察和比较显示,OsSUT5突变体水稻颖果的垩白相对于野生型明显增多,其颖果长度相对于野生型对照也有一定程度的增加,但统计结果表明OsSUT5突变体水稻的千粒重与野生型无显著区别。【结论】OsSUT5在水稻花粉发育甚至受精过程中可能发挥重要作用;敲除OsSUT5对水稻的结实率、籽粒的形态和品质有明显影响。推断OsSUT5在水稻开花结实中的作用（包括对花粉活性和颖果内胚乳发育的影响）与其蔗糖运输功能密切相关。     

过量表达小麦TaCYP78A5增加花器官的大小

【目的】利用表达模式分析、转基因过表达和细胞学观察等策略,解析TaCYP78A5调控花器官大小的功能和机制,为作物遗传改良提供基因资源和理论基础。【方法】根据EnsemblPlants基因组数据库中不同物种CYP78A家族成员的序列信息,对小麦TaCYP78A5和其他物种中的同源基因进行序列比对和进化分析;利用生物信息学分析小麦TaCYP78A5的基因和蛋白结构,以及不同器官的表达模式;通过在拟南芥中组成型过表达和生殖器官局部特异性过表达TaCYP78A5的策略,明确TaCYP78A5具有调控花器官大小的功能;利用显微镜观察不同转基因拟南芥花器官的细胞学特征,解析TaCYP78A5调控花器官大小的细胞学机制;利用小麦转基因过表达策略,明确TaCYP78A5调控小麦穗部大小等其他穗部性状的功能;利用323份小麦品种的单倍型数据与穗部表型数据进行关联分析,探析不同小麦品种TaCYP78A5表达量的高低对穗部大小等其他穗部性状的影响。【结果】小麦TaCYP78A5与拟南芥AtCYP78A5的基因和蛋白序列相似性较低,但基因和蛋白结构相似性较高。小麦TaCYP78A5和拟南芥AtCYP78A5...     

甜瓜短蔓基因Cmdm1的精细定位及候选基因分析

【目的】对甜瓜短蔓突变体Z8进行短蔓基因的精细定位并确定候选基因,为甜瓜株型的分子改良奠定基础。【方法】考察短蔓突变体Z8和野生型B15的主蔓节数、主蔓长度、主蔓节间长度以及侧枝长度等农艺性状。配制Z8/B15杂交组合并进行遗传分析,利用F₂群体中的短蔓单株进行基因精细定位。通过对定位区间内注释基因编码区进行测序以确定候选基因。【结果】与野生型B15相比,突变体Z8节间显著变短导致植株矮化,顶端花序紧凑簇生,遗传分析表明其短蔓性状由一对隐性核基因Cmdm1控制。采用基因图位克隆策略,利用780个F₂短蔓单株最终将该基因精细定位于第7染色体短臂标记c7-112和s2之间约56 kb的区间内,并与标记dm-1共分离,区间内共包含4个注释基因。经测序鉴定,发现Z8中与拟南芥ERECTA同源的MELO3C016916 ATG下游第1 995位碱基由T突变为G而产生终止密码子,导致蛋白翻译提前终止,致使后面激酶结构域完全缺失,推测MELO3C016916即为控制蔓长的Cmdm1。【结论】Z8短蔓性状受隐性核基因Cmdm1控制,利用分子标记最终将该基因定位于7号染色体短臂标记c7-112和s2之间约56 kb区间内,推测MELO3C016916为最有可能的候选基因。     

赤霉素GA4是水稻矮化特征的重要调节因子

【目的】 以水稻幼胚组培过程中获得的一株半矮化水稻突变体为研究对象,解析水稻半矮化突变体株高变矮及分蘖增多等表型异常的原因,为克服水稻过度矮化发育障碍因子及培育抗倒伏高产水稻品种提供科学理论依据。【方法】 首先统计分析半矮化水稻突变体与野生型的表型差异,利用体式显微镜和光学显微镜观察突变体花的结构及其细胞特征;通过转录组测序及qRT-PCR分析差异基因的表达特征,并通过外源喷施赤霉素GA3处理检测突变体对外源赤霉素的敏感性;最后利用高效液相色谱和质谱联仪检测突变体内赤霉素的含量与富集特征。【结果】 表型观测与统计结果表明,突变体水稻株高比野生型减少56.59%,有效分蘖数高出47.44%,差异均达到极显著水平。突变体的表皮毛消失且花发育迟缓,雄蕊变小。尽管突变体分蘖数较高但结实率明显降低,仅为野生型的12.62%,且种子长度和宽度均减小,差异极显著。通过显微镜观察茎的纵切切片,发现突变体细胞长度减少23%,差异极显著。外源喷施赤霉素后突变体的株高、有效分蘖、结实率、种子大小、表皮毛和茎秆细胞长度均有不同程度的恢复,说明植物体内赤霉素合成不足可能是引起水稻矮化的主要原因。转录组测序结果显示突变体中OsGA13ox 显著上调,qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。由于OsGA13ox控制GA12转化为GA53,而GA12和GA53分别转化为GA4和GA1,GA4的活性高于GA1,因此,突变体中GA4减少可能是导致半矮化的主要原因。赤霉素检测结果表明突变体中GA4含量减少94.9%,与预测结果一致。此外,D14作为SL（独脚金内酯）的特异性受体,参与调控植物SL信号转导,抑制枝条分枝或者分蘖。qRT-PCR结果显示,与野生型相比,突变体中D14 显著下调,而经过GA3处理的野生型和突变体中D14 均显著上调。D14 上调可能导致有效分蘖数减少,而其下调可能致使有效分蘖数增加。统计结果表明突变体中有效分蘖显著增多,而经过GA处理之后,野生型和突变体有效分蘖数均显著低于未经GA3处理前,表明D14 在水稻中的表达可能受到GA的调控从而影响水稻分蘖。【结论】 OsGA13ox 异常表达导致活性更高的GA4在水稻中的富集减少,形成水稻半矮化突变体;赤霉素可能通过影响D14 的表达间接调控水稻的分蘖。