美国家禽改良计划条文内容(连载六) (摘自美国《联邦规章典集》第九篇——动物和动物产品) 第147部 国家家禽改良计划——辅助规则

<正>(g)做该试验应具有适合的、平滑的反应板。置备好血清抗原稀释液,以保证在将标准试管凝集试验作对照试验时稀释度不超过1:50。对于火鸡血液样本,最好使用与试管试验法相同的血清抗原稀释度(1:25)。应将血清加入抗原中,并用血清移液管顶端彻底混均抗原和血清。强阳性反应会在15～20s内出现。但最终读数还是应在2min或3min时。37℃左右加热反应板可以加快凝集反应。在读数前应将反应板旋转几次。     

小鼠H-Y单克隆抗体ELISA检测方法的建立

以纯系 BAL B/ c雄性小鼠脾细胞腹腔注射免疫同系雌性小鼠 9次 ,获得的抗血清经雌、雄鼠脾细胞吸收后用于精子细胞毒性试验 ,测得 H- Y抗血清效价为 1/ 16 0。选取免疫应答最好的雌鼠脾细胞与 SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,用精子细胞毒性方法筛选效价较高的细胞株制备腹水 ,建立优化的 EL ISA反应条件。优化后的 EL ISA反应条件为 :抗原4℃过夜 ,加 H- Y抗血清 37℃反应 12 0 m in,加 HRP- Ig G 37℃反应 30 min,加 TMB 2 5℃ 30 min。优化后的 EL ISA与常规 EL ISA比较 ,可以明显降低阴性吸光值 ,检测灵敏度从 1/ 32 0上升为 1/ 12 80     

抗ETEC F18+菌毛特异性IgY的稳定性研究

用间接ELESA方法测定了抗F18^＋ETEC IgY对温度、酸碱度、反复冻融、渗透压、胃蛋白酶、胰蛋白酶的稳定性，并考察非还原性糖（乳糖、蔗糖）对IgY活性的影响。结果表明：60℃水浴30min效价无变化；pH4．0～11．0环境中，IgY活性改变不显著；经7次反复冻融和50％蔗糖渗透压处理，抗原结合活性也几乎未受损失；pH2．5时，该IgY对胃蛋白酶非常敏感，经胃蛋白酶37℃处理4h，效价从1：7200下降到1：450；37℃时分别经胃蛋白酶（pH4）和胰蛋白酶（pH7，5）各处理4h，效价均无变化；在胃蛋白酶的处理中，蔗糖和乳糖对该IgY具有一定的保护作用。     

不同温度及突变方式对菲律宾蛤仔耗氧率的影响

本研究采用静水法测定了不同温度及急性温度突变对菲律宾蛤仔耗氧率的影响,分别在5个恒定温度（15、20、25、30和35℃）以及4个急性温度突变（分别由25℃突变至15、20、30和35℃）条件下测定了菲律宾蛤仔的耗氧率。试验结果表明,温度对菲律宾蛤仔的耗氧率具有显著性影响（P＜0.05）。在温度为15～30℃内时,耗氧率随温度的升高而逐渐增大,随着温度的继续升高达到35℃时耗氧率开始下降。方差分析表明,耗氧率在15℃时最低,与20℃组和35℃组之间差异不显著（P＞0.05）;在30℃时耗氧率最大,与25℃组无显著性差异,但显著高于15℃和20℃组（P＜0.05）。温度突变后菲律宾蛤仔耗氧率相比于恒温状态下均出现不同程度提高,说明温度骤变环境下菲律宾蛤仔要消耗更多的能量。     

青霉素酶特异性抗血清间接ELISA方法的建立

以青霉素酶为抗原,免疫健康獭兔,自行制备青霉素酶特异性抗血清(PcAb),并建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定方法,优化试验条件,测定制备的青霉素酶特异性抗血清效价。结果表面抗原最佳包被浓度为10μg/mL,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 000,阳性血清最佳稀释度为1∶2 000,抗原最佳包被条件为4℃过夜,血清最佳反应时间为37℃1 h,酶标二抗反应最佳时间为37℃1 h,与底物作用的最佳时间为20 min。     

狂犬病口服疫苗在实际储运和环境释放中的消减规律研究

为探索冻干剂、咀嚼剂和喷剂三种剂型的rAd5-ΔE1/E3-CGS狂犬病口服疫苗在运输、保存、反复冻融及不同温度下投放时疫苗效价的消减规律，将三种剂型的疫苗经过2～8℃运输48 h,重新入库的疫苗分别-20℃保存1年和反复冻融5次，再将冻融后疫苗分别于2～8℃保存4个月、15℃放置1个月、25℃放置1周和37℃放置3 d,于不同时间点取样检测疫苗效价(lgTCID₅₀/头份)。结果显示，三种口服疫苗经过2～8℃运输48 h后，效价分别下降至6.25、5.75和6.25,再经过-20℃保存1年和反复冻融5次后效价分别下降至5.67、5.33、5.33和5.33、5.00、5.67。在2～8℃保存4个月后，三种剂型口服疫苗效价均能达到5.00以上；在15℃放置1个月、25℃放置1周以及在37℃放置3 d后，疫苗效价最低分别为3.75、2.50和1.00。研究表明，三种剂型口服疫苗在冷链运输、冷冻保存、反复冻融和低温环境释放条件下具有良好的稳定性，常温环境对咀嚼剂的稳定性影响较小，高温环境会严重降低口服疫苗效价，建议在气温不高于15℃条件下进行rAd5-ΔE1/E3-C...     

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

对AEV陕西分离株VP1基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化.结果表明,VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为50 000的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被质量浓度3.8 mg/L,37℃2h后4℃过夜,1％ BSA 37℃封闭2h,待检血清1∶50稀释37℃孵育0.5h,酶标抗体1:4 000稀释,37℃作用30min,底物37℃显色5 min,临界值为0.360;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率为91.9％.该方法可用于临床样品的大批量检测.     

保存温度、湿度和时间对鹌鹑种蛋孵化成绩的影响

本试验旨在研究鹌鹑种蛋适宜保存温度、湿度、时间及胚胎发育临界温度。采用单因素试验设计,按照蛋重均等原则分组,每组8个重复,每重复50枚;将2400枚种蛋均分为6组,保存温度分别为5、10、15、20、25、30℃;将2000枚种蛋均分为5组,保存湿度分别为40%、50%、60%、70%、80%;将1200枚种蛋均分为3组,保存时间分别为3、7、11 d,检测种蛋孵化率、健雏率等指标。将440枚种蛋均分为11组,保存温度在20~30℃内设置11个水平;将280枚种蛋均分为7组,保存温度在21.8~23℃内设置7个水平;每组40枚,保存5 d,每天每组取8枚测量胚盘直径。结果表明:从入孵蛋孵化率和受精蛋孵化率来看,保存温度15℃组最高,15、20、25℃组高于5、10、30℃组(P<0.05);保存湿度70%组高于40%、80%组(P<0.05),保存3、7 d组高于保存11 d组(P<0.01)。此外,保存温度≥23℃胚盘直径极显著增大。由此可知,鹌鹑种蛋最佳保存温度15℃,适宜范围15~20℃;最佳保存湿度70%,适宜范围为65%~70%;适宜保存时间为3~7 d;胚胎发育临界温度为23.0℃。     

鸡传染性支气管炎病毒血凝抑制试验抗原的研制

为应用血凝抑制(HI)试验检验鸡传染性支气管炎疫苗免疫效力(血清、卵黄抗体水平),建立了鸡传染性支气管炎病毒HI试验抗原的制备方法。该方法是通过选取抗原谱最广的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株,经SPF鸡胚增殖培养36h后无菌收取鸡胚尿囊液,4℃、12 000r/min离心10min,上清用聚乙二醇(PEG)20000浓缩100倍;兔源A型产气荚膜梭菌中国标准株(C57-1株)37℃增殖培养18h,4℃、12 000r/min离心10min取上清,经PEG 20000透析袋浓缩5倍后通过0.20μm滤膜过滤除菌,然后将IBV液和A型产气荚膜梭菌菌液(含α毒素)二者按一定比例混合后经37℃恒温振荡感作2h,4℃经48h后制成。经大量试验表明,制备的IBV HI试验抗原效价高、稳定性好,可替代进口抗原应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清抗体及卵黄抗体的HI效价检测。     

猪圆环病毒2型CaP蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

本研究旨在建立以PCV2 Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0 mmol·L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg·mL-1;血清最佳稀释度为1:40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1 h;血清反应时间为37℃30 min;酶标二抗最适作用时间为37℃45 min;底物最佳反应条件为37℃显色15 min.用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2 ELISA试剂盒得到的结果基本一致.本试验成功建立了PCv2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测.     

牛体外受精胚胎一步脱防冻剂冷冻方法的研究

为了研究适合于牛体外受精胚胎的一步除防冻剂的冷冻方法，特进行两个试验。试验１分别用１．５Ｍ甘油＋０．２５Ｍ蔗糖、１．５Ｍ乙二醇和１．５Ｍ丙二醇作防冻剂冷冻体外受精后第７天，已发育至囊胚阶段的牛胚胎。使胚胎降温至－７℃后，植冰，然后以０．３℃／分的速率降温至－３０℃，立即将胚胎投入液氮中冷冻保存。在３７℃水中解冻胚胎后，使其直接在含１５％胎犊血清（ＦＣＳ）的磷酸缓冲液（ＰＢＳ）中脱去防冻剂。经体外培养７２ｈ后，３组胚胎的孵化率分别为７７．２７％（１０２／１３２）、７３．２４％（１０４／１４２）、４７．９０％（５７／１１９），第１、２组的孵化率极显著高于第３组（Ｐ＜０．０１），说明用１．５Ｍ丙二醇溶液冷冻的胚胎，在解冻后不宜直接在ＰＢＳ中脱防冻剂。试验２比较用不同浓度（１．０Ｍ０１．５Ｍ，２．０Ｍ）的乙二醇和不同投液氮温度（－２５℃，－３０℃，－３５℃）冷冻胚胎的效果。结果表明乙二醇浓度和投液氮温度对胚胎孵化率均无显著影响（Ｐ＞０．０５），各组胚胎的孵化率变动于７４．４４％－８５．４８％之间。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳(N)蛋白作为包被抗原,建立了PRRSV抗体检测的间接ELISA方法,并优化确定了ELISA最佳工作条件:重组抗原包被浓度为13.3 μg/mL,37℃1h或4℃过夜;5％脱脂乳37℃封闭2h;血清1:40稀释,37℃作用90 min;酶标二抗1∶4000稀释,37...     

产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌分离株的生物学特性研究

对发酵黄芪样品中分离的1株产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌的生物学特性进行了检测,试验结果表明,菌株在10℃~60℃环境均能生长,最适生长温度为35℃~40℃。pH5.0~8.0培养基均适宜菌株生长,其中最适pH为6.0。在37℃环境200r/min振荡培养的生长曲线在0~4h为延迟期,4h~12h为对数期,12h~24h为稳定期,24h以后为衰亡期。细菌37℃培养32h开始产生芽胞,在培养72h时芽胞形成率达到80.67%。菌株对多数抗菌药物敏感,且安全性良好。该菌株适应性强,生长条件较为宽松,这为其开发应用提供了依据。     

芽孢杆菌中性植酸酶基因的原核表达及酶学性质分析

植酸酶作为饲料添加剂能够有效提高动物对饲料中磷的利用率及减少粪便中磷排放对环境的污染,并降低植酸的抗营养作用。为了获得性能稳定的高活性植酸酶,采用PCR扩增芽孢杆菌(Bacillus sp.)中性植酸酶基因phyC(GenBank登录号:FJ986327)的成熟肽编码序列,将其克隆进原核表达载体pET-28a(+),并转化E.coli BL21(DE3)进行表达。在37℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导4 h能够获得大量包涵体蛋白,在25℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h有利于可溶性蛋白的获得。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组植酸酶产物,获得的中性植酸酶的部分酶学特性为:耐热性较好,最适反应温度55℃,在70℃处理10 min可保持20%以上的酶活性;耐酸、碱能力较强,最适pH 6.0～7.0,pH 5.5～9.0时能保持80%以上的酶活性,pH 5.0～10.0时处理60 min仍能保持70%以上的酶活性,在pH 2.0～4.0时能保持40%以上的酶活性。利用构建的切除芽孢杆菌中性植酸酶基因phyC信号肽编码序列的原核表达载体及优化的诱导表达条件,能够在大肠杆菌中高量表达性能稳定的芽孢杆菌中性植酸酶。     

两种早熟禾超氧物歧化酶活性测定的适宜条件

以冷地早熟禾 (Poacrymophila)和草地早熟禾 (P .pratensis)为材料 ,探讨光照反应时间、酶浓度以及酶反应体系等对NBT光化还原反应的影响。随着光照反应时间的延长 ,最大光还原值直线上升。 2 5min后光化还原值逐渐趋于稳定。光照反应开始后 ,酶液对NBT光化还原反应速率的抑制百分率迅速升高 ,在 15～ 2 5min时 ,酶液对NBT光化还原反应的抑制百分率保持稳定 ,2 5min后下降速率较大。光照反应时间对SOD酶活性测定的影响较大 ,确定为 2 5min较为适宜。酶浓度在 4 0～ 6 0mg/mL时光化还原值变化速率较一致。测定中反应体系NBT、核黄素的加样量以及光照强度在一定范围内时光化还原值较为稳定     

青藏高原高寒草甸种子萌发行为沿海拔梯度的分异特征

为探究海拔梯度上高寒草甸植物种子萌发行为的分异特征及温度对不同海拔种群萌发行为的影响，本研究选取青藏高原东缘高寒草甸为研究区，选用31种常见植物种，沿海拔梯度共采集79个种群的种子，设置昼夜温度15℃/5℃和25℃/10℃开展萌发试验，探讨高寒草甸植物种子萌发行为与海拔的关系。研究结果表明：温度对种子萌发行为影响显著，25℃/10℃比15℃/5℃处理下的半数萌发时间（The time to achieve 50% germination，T₅₀）缩短7.20 d，萌发率（Germination percentage，GP）增加12.83%。萌发行为与海拔间的关系与萌发温度有关，15℃/5℃处理下，海拔对T₅₀的影响不显著，GP随海拔的升高显著增加；但在25℃/10℃处理下，T₅₀随海拔升高而显著延长，GP随海拔升高显著下降。温度升高时，部分高海拔种群中的种子倾向选择延迟萌发。延迟萌发对策能够促进有限的环境资源在时间和空间尺度上分化，有利于避免不可预测环境下大量同步萌发所面临的灭绝风险，对物种更新和续存起到重要作用。     

垂穗披碱草ISSR反应体系的正交优化

以垂穗披碱草(Elymus nutans)基因组DNA为模板,对ISSR-PCR反应体系中5个因素(TaqDNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)进行优化试验.建立垂穗披碱草稳定的ISSR-PCR反应体系及最佳扩增程序.在25 μL反应体系中,最佳反应体系为2.5 μL 10×buffer(不含Mg2+)...     

牛乳中荧光假单胞菌耐热性脂肪酶的活性影响因素

以新鲜牛乳中分离到的荧光假单胞菌为研究对象,对其分泌产生的耐热性脂肪酶进行纯化,并研究不同温度、pH值、Ca2+质量浓度对该脂肪酶活性的影响.结果表明:经过初步纯化的脂肪酶分子质量为55 kD,纯度为91.5％,并且发现该耐热性脂肪酶在50℃、30 min,63℃、30 min,72℃、20 s,90℃、10 min,121℃、0.1 MPa、20 min处理之后,相对酶活力分别为75.02％、86.21％、73.25％、17.62％、13.63％;并且该脂肪酶的最适温度为63℃,最适pH值为8.0;在荧光假单胞菌体外,Ca2+质量浓度对荧光假单胞菌脂肪酶的活力并无显著影响.     

不同温度条件下土壤颗粒组成对宽叶雀稗种子发芽与幼苗生长的影响

为探讨水土流失区表层土壤砂砾化环境对植物种子萌发及幼苗生长的影响,选取我国南方水土保持良种宽叶雀稗为试验材料,设置4个温度梯度(15、20、25、30 ℃),按不同径级的土壤颗粒组成配制5种不同程度砂砾化的土壤作为种子发芽基质,研究温度和土壤颗粒组成对宽叶雀稗种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明:温度和土壤颗粒配比对宽叶雀稗种子发芽与幼苗生长均有显著影响。随着温度升高,宽叶雀稗种子发芽初始时间提前,发芽率稳定所需时间缩短,发芽速率加快;20、25 ℃时,种子发芽率与发芽势较高,地上部与根系生物量较大;20、25、30 ℃时,种子发芽指数、活力指数较高,苗高较高,根长较长;长度根冠比随着温度升高先降后升,25 ℃时最小。宽叶雀稗种子在土壤粗颗粒含量较高(>2 mm:1~2 mm:<1 mm=100%:0%:0%)时,种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均为最低;土壤粗细颗粒含量适中(>2 mm:1~2 mm:<1 mm=25%:37.5%:37.5%或50%:25%:25%)时,种子发芽指数、活力指数较高。苗高随着土壤粗颗粒含量的增加逐渐增大,根长、长度根冠比则随土壤粗颗粒比例的增加而降低,幼苗地上部与根系生物量则在土壤粗细颗粒含量适中(>2 mm:1~2 mm:<1 mm=50%:25%:25%或75%:12.5%:12.5%)时较高,说明土壤粗颗粒比例高有利于宽叶雀稗苗高生长,土壤细颗粒比例高有利于根系生长,土壤粗细颗粒比例适中有利于种子发芽及幼苗生物量的积累。