雏鸡T淋巴细胞及其亚群的变化规律

白细胞分化抗原是白细胞在分化成熟为不同谱系和分化不同阶段以及活化过程中 ,出现或消失的细胞表面标记 [1]。鸡的 T淋巴细胞表面分化抗原的研究近年来进展较快 ,证明与哺乳动物的 T淋巴细胞表面分化抗原有许多相似之处 ,尤其以 CD3,CD4,CD8为突出。 CD3分子表达于所有成熟 T细胞表面 ,可与 TCR( T细胞抗原识别受体 )分子以非共价结合形成一个 TCR- CD3复合物 ,其中 TCR是识别异种抗原和自身 MHC分子多态性决定簇的受体 ,而 CD3分子具有稳定 TCR结构和传递活化信号的作用 [2 ] ,CD3是鉴定 T细胞的重要标记。T细胞可分为辅助…     

梅山猪CD14基因多态性及其对部分免疫指标和繁殖性能的关联分析

试验旨在研究梅山猪白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen 14,CD14)基因多态性及其对部分免疫指标和繁殖性能的遗传效应。采用PCR-RFLP方法对梅山猪CD14基因-61bp处多态性进行分析,同时对部分重要细胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β1)水平及繁殖性能(总产仔数、断奶仔猪数、初生窝重和断奶窝重)进行测定,并分析CD14基因多态性与部分免疫指标和繁殖性能的相关性。结果显示,梅山猪CD14基因-61bp处经BamHⅠ酶切后共检测到3种基因型,分别定义为:AA、AG和GG;χ2适合性检验显示,梅山猪处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05);多态信息含量(PIC)分析显示,梅山猪群体处于中度多态。关联分析结果表明,AA和AG基因型个体的IL-10水平显著高于GG基因型个体(P0.05);在初产母猪中,3种基因型间的繁殖性能均无显著差异(P0.05),而在经产母猪中,AA和AG基因型个体的断奶窝重显著高于GG基因型个体(P0.05)。本试验结果表明,基于CD14基因-61bp处多态性对梅山猪进行分子选育时,无论是一般抗病力还是繁殖性能,GG基因型可能均为不利基因型,可以将CD14基因-61bp处作为一个潜在的遗传标记进行深入系统的验证和分析。     

猪Fc_γRⅡb亚型(Fc_γRⅡb1)基因的分子克隆及鉴定

IgG Fc受体(FcγRs)的一个主要效应机制是可结合IgG免疫复合物发生反应。目前已鉴定出的FcγRs有4类:高亲和力的FcγRⅠ(CD64),中等亲和力的FcγRⅠ、FcγRⅡ(CD32),以及低亲和力的FcγRⅢ(CD16)。人FcγRⅡ主要有FcγRⅡa、FcγRⅡb、FcγRⅡc 3个亚型;小鼠有1个亚型FcγRⅡb;牛有2个亚型FcγRⅡb、FcγRⅡc。人、小鼠、牛中FcγRⅡb又包括2个亚型:FcγRⅡb1(b1)和FcγRⅡb2(b2),但有关猪FcγRⅡb亚型的研究鲜有报道。本研究对猪FcγRⅡb亚型(FcγRⅡb1)进行了分子克隆、测序及鉴定,并运用RT-PCR从猪外周血白细胞RNA中扩增出猪FcγRⅡb1cDNA序列。结果发现,猪FcγRⅡb1cDNA序列包含一个951bp的开放阅读框(ORF),可编码316个氨基酸跨膜糖蛋白,包括两个免疫球蛋白(Ig)样胞外结构域,一个跨膜区域,一个带有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的胞质尾区。猪FcγRⅡb1cDNA序列与DQ026064同源性为98.3%,其在胞质尾区有一19个氨基酸的插入框。荧光免疫试验结果发现,猪FcγRⅡb1cDNA序...     

梅山猪CD14基因-61位点的多态性及其与繁殖性能的关联分析

为了探讨将白细胞分化抗原14(Cluster of differentiation antigen 14,CD14)作为繁殖性能遗传标记的可行性,试验采用PCR-RFLP方法对64头梅山猪种猪CD14基因-61位点的多态性进行检测,同时利用广义线性模型(GLM)分析其与繁殖性能间的关系。结果表明:梅山猪CD14基因-61位点经Bam HⅠ酶切后可检测到AA、AG、GG 3种基因型,其频率分别为0.406,0.500,0.094;遗传多态性分析表明,梅山猪CD14基因的多态信息含量(PIC)为0.349,介于0.25~0.5之间,表现为中度多态;关联分析结果表明,在初产母猪中,GG基因型个体的总产仔数显著低于AA基因型和AG基因型(P0.05),且GG基因型个体的产活仔数、断奶仔猪数、初生重和断奶重均低于AA基因型和AG基因型,但差异均不显著(P0.05);在经产母猪中,各性状之间差异不显著(P0.05)。CD14基因-61位点的多态性对梅山猪初产母猪的繁殖性能有显著的遗传效应,但其对经产母猪的繁殖性能没有显著影响。说明梅山猪CD14基因-61位点并不能作为繁殖性能的分子遗传标记,但如果基于梅山猪CD14基因-61位点对于梅山猪的一般抗病力进行分子选育,不会对梅山猪的繁殖性能产生显著的不利影响。     

乌金猪、青峪猪和成华猪免疫器官多种免疫调节基因表达的比较

为了阐明乌金猪、青峪猪和成华猪这些地方猪种繁殖力高、抗病耐逆性强等分子免疫特征,采用实时荧光定量PCR方法,研究乌金猪、青峪猪、成华猪与约克夏猪的胸腺、脾脏、扁桃体、肠系膜淋巴结和肺门淋巴结中的选择素-L(CD62L)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和白细胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15)mRNA的表达差异。结果显示:成华猪胸腺IL-2、IL-12、IL-6、IL-7、CD62L,脾脏IL-15,扁桃体CD62L,肠系膜淋巴结IL-2,肺门淋巴结TGF-β1 mRNA表达量均显著高于其他猪种(P0.05);乌金猪胸腺TGF-β1,脾脏CD62L,扁桃体IL-6、IL-7,肠系膜淋巴结IL-4 mRNA表达量显著高于其他猪种(P0.05);青峪猪肺门淋巴结IL-4、CD62L mRNA表达量显著高于其他猪种(P0.05)。研究结果为培育抗病力强的动物新品种和筛选抗病分子标记提供科学依据。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白优势B细胞表位重组蛋白免疫原性研究

猪圆环病毒2型(PCV-2)衣壳蛋白(Cap)是研制基因工程疫苗和血清抗体检测方法的主要候选抗原。为筛选免疫原性强的Cap抗原表位,将定位在Cap上的6个B细胞线性表位的编码基因序列重新组合,命名为R1234、R1235、R1236、R2345、R2346和R3456,然后克隆至pET32a原核表达载体,转化到大肠埃希菌中进行诱导表达。通过对表达和纯化条件的优化,最终获得6个多抗原表位串联体的重组蛋白。Western blot和间接ELISA结果显示,6组重组表位蛋白均能被PCV-2阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。将其与完整Cap分别免疫Balb/c小鼠,检测免疫后血清中特异性抗体和细胞因子水平以及脾脏淋巴细胞中CD4^+和CD8^+T淋巴细胞的比例。结果表明,R2346组合刺激机体产生的特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4的水平明显高于其他组,脾脏淋巴细胞中CD4^+和CD8^+T淋巴细胞含量与对照组相比显著增加(P<0.05),说明该重组蛋白能够刺激体液免疫和细胞免疫反应。因此,筛选获得的R2346重组表位蛋白可以作为研制PCV-2多表位基因工程疫苗和血清抗体诊断方法的候选抗原,用于PCV-2的预防和控制工作中。     

梅山猪CD14基因多态性及其对部分免疫指标和繁殖性能的关联分析

试验旨在研究梅山猪白细胞分化抗原14（cluster of differentiation antigen 14，CD14）基因多态性及其对部分免疫指标和繁殖性能的遗传效应。采用PCR-RFLP方法对梅山猪CD14基因-61 bp处多态性进行分析，同时对部分重要细胞因子（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β1）水平及繁殖性能（总产仔数、断奶仔猪数、初生窝重和断奶窝重）进行测定，并分析CD14基因多态性与部分免疫指标和繁殖性能的相关性。结果显示，梅山猪CD14基因-61 bp处经BamHⅠ酶切后共检测到3种基因型，分别定义为：AA、AG和GG；χ²适合性检验显示，梅山猪处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）；多态信息含量（PIC）分析显示，梅山猪群体处于中度多态。关联分析结果表明，AA和AG基因型个体的IL-10水平显著高于GG基因型个体（P<0.05）；在初产母猪中，3种基因型间的繁殖性能均无显著差异（P>0.05），而在经产母猪中，AA和AG基因型个体的断奶窝重显著高于GG基因型个体（P<0.05）。本试验结果表明，基于CD14基因-61 bp处多态性对梅山猪进行分子选育时，无论是一般抗病力还是繁殖性能，GG基因型可能均为不利基因型，可以将CD14基因-61 bp处作为一个潜在的遗传标记进行深入系统的验证和分析。     

猪圆环病毒2型感染对猪CD80和CD86 mRNA表达的影响

通过构建猪共刺激分子CD80和CD86的缺失cDNA竞争分子,用竞争PCR技术定量检测了猪圆环病毒2型(PCV2)感染后猪肺泡巨噬细胞(PAM)中CD80和CD86的mRNA水平,分析了PCV2感染对猪共刺激分子CD80和CD86的mRNA表达的影响.结果显示,PCV2感染后,PAM中CD80和CD86的mRNA水平变化趋势一致,只是CD86的升降幅度更大.在PCV2感染后3d,CD80与CD86的mRNA水平下降至最低,随后迅速上升,至14d达到高峰,尔后快速下降,21d及以后恢复正常.本研究结果表明,PCV2初期可明显抑制猪共刺激分子CD80和CD86的基因转录.     

贵州白香猪apoA5基因多态性初步分析

贵州白香猪为贵州特有的地方品种,为了研究贵州白香猪apoA5基因多态性,试验采用直接测序法对贵州白香猪apoA5基因全序列2 473 bp进行单核苷酸多态性(SNPs)检测.结果表明:在apoA5基因的内含子2和外显子3中分别检测出1个、11个变异位点;有4个突变发生在氨基酸编码区内,其中3个突变为同义突变,而G1 1...     

猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻病毒抗原成份分析

采用聚乙二醇沉淀法结合蔗糖梯度密度离心法纯化了猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)两种病毒.SDS-PAGE 分析表明,TGEV 有六种蛋白成份,依次为 VP_1(33KD)、VP_2(41KD)、VP_3(58KD)、VP_4(60KD)、VP_5(142KD)和 VP_6(200KD);PEDV亦有六种蛋白成份.为VP_1(33KD)、VP_2(40KD)、VP_3(53KD)、VP_4(62KD)、VP_5(163KD)和VP_6(190KD).两种病毒的结构蛋白间的差异主要表现在 VP_5上.Westen-Blot 分析证明,TGEV 与 PEDV 在VP_2和 VP_4处存在抗原活性交叉反应,其它结构蛋白则无,VP_1和 VP_2为基质蛋白,VP_3和 VP_4为核蛋白,VP_5和 VP_6为纤突蛋白,病毒纤突蛋白可诱生中和抗体.因此认为,TGEV 和 PEDV 在 VP_5结构蛋白上表现出来的差异很可能是导致两种病毒间无血清学交叉反应的分子基础.两种病毒在 VP_2和 VP_4处有抗原活性交叉反应,这可能由于两种病毒的基质蛋白和核蛋白在生物进化中有一定亲缘关系。     

胸腺外CD4和CD8双阳性T细胞的研究概述

胸腺依赖性细胞即 T细胞具有多种重要的免疫功能 ,不同的免疫功能与其细胞膜上的分化抗原 (CD)的种类相关联。其中 CD4和 CD8是关键的分化抗原。 CD4分子是单链糖蛋白 ,是自身主要组织相容性复合体 (MHC) 类抗原的受体。研究表明 ,其功能性分子可能是低聚体 [1 ] 。CD8分子也是糖蛋白 ,包含α链和β链 ,是 MHC 类抗原的受体。 CD4和 CD8与相应 MHC抗原结合是 T细胞在胸腺外发挥免疫功能的生化基础 ,也与 T细胞在胸腺微环境中的分化有关。来自骨髓的前 T细胞表面无任何 CD标志 ,在胸腺微环境中先后表达CD2、CD7、CD3抗原和 T…     

实验用荣昌猪SLA-1等位基因鉴定及分子遗传特征分析

旨在明确实验用荣昌猪SLA遗传背景，深入研究SLA-1分子相关的抗原递呈和免疫应答机制，本研究对27头荣昌猪采集抗凝血，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA,设计特异性引物对SLA-1基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序，对获得序列的分子特征进行分析。结果显示，荣昌猪中共获得11个SLA-1等位基因，其中，9个为新等位基因，全部获得GenBank登录号和ISAG SLA命名委员会官方命名，SLA-1^*24:01等位基因在该群体中频率最高。SLA-1基因编码区全长1 086 bp,存在127个核苷酸多态位点，非同义单核苷酸多态性位点数高于同义单核苷酸多态性位点数。核苷酸多样度为0.044 9,单倍型多样度为1,平均核苷酸差异数为48.782,G+C含量为64.9%。SLA-1基因编码的361个氨基酸中，有75个氨基酸变异位点；第2和第3外显子编码区多态性最高，且第2外显子区域的氨基酸变异程度高于第3外显子区，组成抗原肽结合槽6个口袋的33个关键氨基酸位点中，11个在人与荣昌猪之间高度保守，与β2-微球蛋白结合的19个关键氨基酸位点中，10个保持一致，CD8分子与MHC结...     

猪圆环病毒核酸疫苗pcDNA-PCV-ORF2-ISS的构建及分子佐剂联合免疫研究

用PCR方法扩增猪圆环病毒PCVwhn株编码CAP蛋白的基因ORF2,同时人工合成一段CpG序列,并设计上下游引物,进行扩增,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建新型核酸疫苗(pcDNA-PCV-ORF2-ISS),并进行了酶切和测序鉴定.用构建的pcDNA-PCV-ORF2-ISS质粒以及pcDNA-PCV-ORF2与5种细胞因子分子佐剂质粒(IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ真核表达质粒)联合对仔猪进行免疫试验.免疫后用间接ELISA法测定猪圆环病毒Ⅱ型特异性抗体IgG,用流式细胞仪测定猪血液CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚类的数量.结果显示,成功构建含CpG免疫刺激序列的猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗;pcDNA-PCV-ORF2-ISS在仔猪免疫实验能诱导细胞免疫并产生特异性抗体(P<0.05);用5种细胞因子分子佐荆质粒与pcDNA-PCV-ORF2疫苗同时免疫能显著提高DNA疫苗的免疫效果(P<0.05).分子佐剂免疫增强效果次序为:IL-6、CpG、IL-6/4、IL-2、IL-4和IFN-γ,表明IL-6和CpG最佳.     

猪CD3ε分子的cDNA 克隆与序列分析

应用RT-PCR和3′RACE技术，本研究从猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪CD3ε基因并进行了序列分析。序列分析结果表明，猪CD3ε cDNA序列长1241nt，其中5′非翻译区80nt，3′非翻译区570nt，开放阅读框591nt，该开放阅读框编码196个氨基酸残基的CD3ε前体蛋白(无糖基化位点)；在猪CD3ε蛋白的胞外区，Cys^49、Cys^91、Cys^108和Cys^111为保守性氨基酸残基，它们与CD3ε免疫球蛋白样结构的形成有关。在猪CD3ε蛋白胞浆区，存在免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)、内质网潴留基序和1个SH3结合基序，其中ITAM基序含有2个SH2结合基序和2个潜在酪氨酸磷酸化位点Tyr^177和Tyr^188，这些基序是猪CD3分子参与T细胞活化信号转导和TCR-CD3复合体装配的结构基础。推导氨基酸序列分析结果表明，猪与人、鼠、狗、牛和绵羊CD3ε蛋白的氨基酸同源性分别为61．2％、58．7％、58．7％、65．1％和65．6％。     

表达猪CD3ε蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性测定

CD3分子是T细胞重要的表面分子,表达于成熟T细胞表面,与TCR组成TCR—CD3复合物,在T细胞的分化增殖以及功能方面有着重要的作用。自1979年Kung等首次制备了抗人类CD3单克隆抗体OKT3以来,陆续有多种动物的CD3单克隆抗体被成功制备。CD3分子的单克隆抗体在T细胞亚群检测等方面具有重要的应用价值。猪CD3单克隆抗体制备在国内还未见报道。CD3由γ、δ、ε、ξ、η五条多肽链组成,其中多数单克隆抗体均是针对ε链。本研究成功构建了表达猪CD3ε基因的重组腺病毒,并对其免疫原性进行了测定,以期为猪CD3ε单克隆抗体的制备奠定基础,并为其他细胞表面分子单克隆抗体的制备提供借鉴。     

猪CD4分子的全长cDNA克隆与序列分析

CD4分子为动物辅助性T细胞（TH）和部分胸腺细胞的共受体与信号传导分子，参与TCR介导的TH细胞活化和胸腺细胞分化过程。本研究应用RT-PCR和RACE技术从猪胸腺细胞总RNA中扩增克隆了猪CD4全长cDNA序列，并进行了序列特性分析。序列分析结果表明，在猪胸腺细胞和外周血淋巴细胞中存在2种方式剪接的CD4 mRNA转录本，其中一种mRNA转录本缺失编码40个氨基酸残基的120nt序列，提示该转录本可能编码猪分泌型CD4分子；猪CD4全长cDNA序列为2715nt。其中5′非编码区159nt，3′非编码区1183nt，1374nt的开放阅读框编码457个氨基酸的猪CD4前体蛋白（含4个糖基化住点）；猪CD4分子的7个Cys残基（Cys^43、Cys^122、Cys^327、Cys^418、Cys^421、Cys^444和Cys^446）和2个Ser残基（Ser^432和Ser^439）在动物种间保守；在猪CD4分子胞浆区．存在高度保守的Src家族蛋白酪氨酸激酶p56^kk。识别位点KKTCQC和内化相关双亮氨酸基序。推导氨基酸序列分析结果显示，猪与人、免、猫、狗和鼠CD4蛋白的氨基酸同源性分别为56．0％，54．5％。56．9％，56．5％和44．9％。     

广西猪源益生菌的分离鉴定与生物学特性研究

为了解广西地区猪粪便与微生态发酵饲料中益生菌的存在情况及合理开发和利用猪源益生菌,本试验共采集了15份猪粪便样品和5份益生菌发酵饲料并对其进行益生菌的分离,研究益生菌的形态学特性、生理生化特性及16S rRNA分子序列,进行生长曲线、耐胆盐试验、温度敏感试验、模拟胃肠道耐受试验、耐药性试验、体外抑菌试验、小鼠安全性试验、体内/外抑菌试验,对分离菌株进行生物学特性的研究分析。结果显示,本试验共分离鉴定出6种、29株益生菌,分别为1株屎肠球菌(C2)、2株乳酸肠球菌(C1、C3)、3株植物乳杆菌(R20、R30、R37)、4株干酪乳杆菌(R41～R44)、7株枯草芽孢杆菌(K1～K7)和12株蜡样芽孢杆菌(Y1～Y12)。从中筛选出6株具有生长性能好、耐胆盐、耐高温、对胃肠道耐受、体外抑菌能力强的益生菌:乳酸肠球菌C1、屎肠球菌C2、植物乳杆菌R20、干酪乳杆菌R41、枯草芽孢杆菌K1和蜡样芽孢杆菌Y3。将筛选出的具有优良特性的菌株进行小鼠安全性试验,结果表明,在10~9 CFU/mL浓度下灌胃6株益生菌对小鼠是安全无毒害的。与此同时,C2、R20、R41、Y3能极显著提高小鼠日增重(P0.01),K1能显著提高小鼠日增重(P0.05)。体内抑菌试验结果表明,C2、R20、K1能降低沙门氏菌G21感染的小鼠的死亡率,有一定程度的体内抑菌作用。各项试验结果表明,R20和K1可作为猪源益生菌的选择菌株。     

淳安花猪5个功能基因的多态性研究

为深入挖掘淳安花猪优良种质特性,本研究运用PCR-RFLP方法,对淳安花猪的雌激素受体(ESR)基因、促卵泡激素β亚基(FSHβ)基因、生长激素受体(GH)基因、黑素皮质激素受体4(MC4R)基因、兰尼定受体(RYR1)基因进行分子遗传学检测。结果表明:淳安花猪MC4R、RYR1基因分别只有1种基因型AA、BB;ESR、GH基因各有2种基因型AB和BB。     

动物甜味受体研究进展及猪饲料甜味剂的选择

动物的味觉识别是通过口腔味觉细胞中的味觉受体来启动。味觉受体T1R家族中的T1R2和T1R3以异构体方式发挥甜味识别作用,其中T1R2起主导作用,T1R3对T1R2结合位点构象起调节作用。猪与人在甜味受体基因序列上存在种族差异,导致猪与人在味觉感觉上存在明显不同,对人很甜的一些人工甜味剂(如索马甜、甜蜜素、NHDC、阿斯巴甜等)不能被猪识别,其对猪不能起到甜味作用。     

贵州白香猪apoA5基因多态性初步分析

贵州白香猪为贵州特有的地方品种,为了研究贵州白香猪apoA5基因多态性,试验采用直接测序法对贵州白香猪apoA5基因全序列2 473 bp进行单核苷酸多态性(SNPs)检测。结果表明:在apoA5基因的内含子2和外显子3中分别检测出1个、11个变异位点;有4个突变发生在氨基酸编码区内,其中3个突变为同义突变,而G1 185A突变为非同义突变,导致了密码子由CGC突变为CAC,从而导致氨基酸由精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His);另外7个突变位点发生在3'-UTR;在检测出的12个变异位点中,G1 690C及G1 821C突变符合Hardy-Weinberg平衡状态,其余10个位点偏离了Hardy-Weinberg平衡。