猪瘟活疫苗生产工艺改进现状

猪瘟（classicalswinefever,CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪的高致死性接触性传染病。CSFV属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestvirus）成员之一,其囊膜糖蛋白E2是诱导机体产生中和抗体的主要抗原蛋白。CSFV与同属,     

猪瘟疫苗的“前世今生”

猪瘟病毒猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒科,是世界范围内最重要的猪病病毒。分子特性:单正股RNA,结构蛋白有衣壳蛋白(C)和3种囊膜糖蛋白(E0、E1、E2)。E0蛋白是唯一分泌到CSFV感染细胞血清中的糖蛋白,在机体内可诱导产生中和抗体;E2则是引起猪产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,在猪瘟诊断和新型疫苗的研究上都起着重要的作用。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞中的分泌表达及活性检测

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E0和E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，均能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击。尤其是E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原，同时还是研究CSFV抗原变异的主要区域。鉴于E2基因在CSFV感染、复制和免疫方面的重要作用，因此一直是猪瘟病毒研究的热点。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立

分别用原核表达的猪瘟病毒（CSFV）主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6.间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应.将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板（捕捉抗体）,与兔抗CSFV IgG（检测抗体）联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值.最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%.     

中国南方典型猪瘟病毒遗传多样性和猪瘟病毒毒株正选择分析

典型猪瘟病毒（CSFV）在世界范围内导致高度传染性疾病流行．给生猪产业造成巨大的经济损失。目前一直缺乏中国南方地区CSFV的准确的基因分型。这项研究对2008～2010年分离到的中国南方地区家猪不同毒株的E2基因进行分析（14株猪瘟病毒）。系统发育分析表明，     

用裁截的E2重组蛋白作为抗原建立ELISA检测猪瘟病毒抗体

猪瘟 ( CSF)是猪的一种传染性致死性疫病 ,该病在家猪群和野猪群中流行传播 ,造成地方流行性感染。猪瘟病毒 ( CSFV)是黄病毒科瘟病毒属成员之一 ,本属中还有另 2种具有经济重要性的病毒 :边界病病毒 ( BDV)和牛病毒性腹泻病毒( BVDV)。瘟病毒属成员在结构上和抗原性上密切相关。 CSFV的基因组为长约 1 2 .3kb的正极性RNA,其编码为单一多蛋白 ,形成成熟的病毒蛋白。CSFV感染后 ,在猪体内产生抗结构蛋白 E2 、Erns及非结构蛋白 NS3抗体。囊膜糖蛋白 E2 是CSFV最具免疫原性的蛋白。为在无疫区进行CSF监测 ,或开展 CSF扑灭计划…     

猪瘟病毒LOM株的一个感染性的cDNA克隆的建立和特征

典型猪瘟病毒（CSFV）在猪群中具有高度传染性，给世界经济造成重大的影响。典型猪瘟病毒（CSFV）LOM株是1956年从日本分离的低毒力Miyagi株的致弱株毒。用RT—PCR获得了LOM株CSFV基因组的8个基因片段。     

猪瘟病毒E2基因原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

猪瘟(CSF)是猪的一种高度接触性的致死传染病。其病原体猪瘟病毒(CSFV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)中的成员,为有囊膜的单股正链RNA病毒。E2蛋白是猪瘟病毒的跨膜结构蛋白,是诱导被感染动物机体产生免疫保护     

广西猪瘟流行现状的调查分析

据对广西13个发病猪场（疫点）猪瘟（CSF）的流行病学调查分析，发现当地CSF流行以非典型为主，典型CSF同时存在，发病猪多在3月龄以下且病程较长。母猪存在隐性感染，部分表现为繁殖障碍，一些临床健康猪存在着带毒问题。此外，从凝似CSF病料中扩增出牛病毒性腹泻病毒（BVDV），表明广西猪群中存在着BVDV的感染。分子流行病学调查结果表明，猪瘟病毒（CSFV）广西流行株的基因型较复杂，分布2个基因群的4个亚群，其亲缘关系与2个传统毒株石门株（Shimen）和兔化弱毒株（HCLV）相距甚远，最高可达20.0%，说明广西CSFV流行株存在着遗传多样性。     

猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及抗E2蛋白单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV）石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞术（FACS）分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆和筛选获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗可与CSFV产生特异性反应并具有中和活性.     

猪瘟病毒囊膜结构(糖)蛋白Erns和E2的生物学特性研究

猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)和长颈鹿瘟病毒(Giraffe pestvirus)为黄病毒科瘟病毒属成员,其病毒结构、抗原性和遗传特性密切相关.CSFV囊膜结构(糖)蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.囊膜结构(糖)蛋白Erns/E0(gp48)具有BNA酶活性,在病毒增殖及中和病毒感染中发挥重要作用,是诱导机体产生保护性免疫应答的第二抗原蛋白.E2和Ens与细胞表面受体的相互作用介导CSFV对细胞的感染过程.本文综述CSFV囊膜结构(糖)蛋白Erns和E2的生物学特性研究进展.     

猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

以纯化的猪瘟病毒（CSFV）重组E2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测CSFV抗体的PPA-ELISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病毒（PRRSV、PPV、JEV、PCV-2、PEDV、PRV、TGEV）及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与间接血凝试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为86.2%,85.4%,87.2%;与IDEXX ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为91.3%,93.2%,88.7%。表明本试验研制的E2-PPA-ELISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性,将为CSFV的快速诊断、免疫猪群抗体水平监测和CSFV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体的制备及其中和活性鉴定

本实验室前期制备了1株分泌针对猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞株6E10,并验证其可特异性识别CSFV E2蛋白。由于杂交瘤细胞不稳定且不易储存，本研究将6E10抗体的轻、重链可变区基因和猪源抗体的恒定区基因融合并克隆至慢病毒表达载体pFUGW,分别构建了携带Strep标签的重组猪源化抗体轻、重链基因的慢病毒质粒pFU-p6E10-LC-Strep和pFU-p6E10-HC-Strep,进一步制备了慢病毒Lenti-p6E10-LC-Strep和Lenti-p6E10-HC-Strep,将二者共转导至HEK293S悬浮细胞，成功表达并纯化了重组猪源单克隆抗体6E10(p6E10)。经ELISA试验及Western blot证实，p6E10抗体能特异性识别E2蛋白。中和试验结果显示，p6E10抗体可以中和CSFV石门株。结果表明，本研究成功获得了针对CSFV E2蛋白的重组猪源化单克隆抗体p6E10,为深入研究CSFV E2蛋白的结构和功能以及开发新型诊断制剂奠定了基础。     

猪瘟病毒囊膜结构(糖)蛋白E~(rns)和E2的生物学特性研究

猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)和长颈广鹿瘟病毒(Giraffe pestvirus)为黄病毒科瘟病毒属成员,其病毒结构、抗原性和遗传特性密切相关。CSFV囊膜结构(糖)蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。囊膜结构(糖)蛋白Erns/E0(gp48)具有RNA酶活性,在病毒增殖及中和病毒感染中发挥重要作用,是诱导机体产生保护性免疫应答的第二抗原蛋白。E2和Ens与细胞表面受体的相互作用介导CSFV对细胞的感染过程。本文综述CSFV囊膜结构(糖)蛋白Erns和E2的生物学特性研究进展。     

猪瘟病毒E2蛋白与猪RACK1相互作用的鉴定

为筛选和鉴定与猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白相互作用的猪宿主蛋白,我们采用酵母双杂交方法筛选猪肺泡巨噬细胞表达文库得到与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞RACK1蛋白,经共转化试验和GST pull-down试验进一步证实两者可以特异性结合,并且共聚焦试验表明两者共定位于细胞的细胞浆。本研究显示E2蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,RACK1在CSFV感染过程中所发挥的功能有待进一步研究。     

猪瘟病毒化学发光抗体检测方法的建立与应用

旨在建立猪瘟病毒（CSFV）化学发光抗体检测方法,本研究以CSFV E2蛋白作为包被抗原,山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体,鲁米诺为底物溶液,优化检测方法,成功建立CSFV化学发光抗体检测方法。该方法能在室温20 min内完成对CSFV抗体血清特异性检测,灵敏度与商品化CSFV抗体检测试剂盒相当,且与A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清均无交叉反应;批内变异系数为1.80%~6.88%,批间变异系数为1.11%~9.18%,重复性好。通过对152份田间猪血清样品的检测并与商品化CSFV抗体检测试剂盒检测结果进行比较,其Kappa值为0.929,具有高度的一致性。综上表明,本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好、简单快速,可应用于临床血清CSFV抗体的检测。     

猪瘟病毒HL-LY地方株E2基因在毕赤酵母中的高效表达

猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的危害养猪业的主要传染病之一，CSFV是以单股正链RNA为遗传物质的黄病毒科瘟病毒属成员。是一种致死性疾病，给养猪业造成了巨大的经济损失口。其基因组大小约为12．3～12．5kb，只含有一个大的开放阅读框架（ORF），编码一个3900个氨基酸的大多聚蛋白一，此多聚蛋白经病毒和宿主细胞的蛋白酶作用，可形成4个成熟的结构蛋白，即衣壳蛋白C和糖蛋白E0、E1、E2，另外还包括7个非结构蛋白一。     

研究发现猪瘟病毒毒力增强决定因子在E2和NS4B中

有许多典型猪瘟病毒（CSFV）毒株，它们的毒力不同，低毒力和温和型猪瘟病毒导致温和、慢性型猪瘟，而高毒力的毒株导致急性型猪瘟（有严重出血热的症状）。ALD强毒株多次在猪、牛和天竺鼠细胞上传代获得减毒疫苗株GPE（-）。     

猪瘟病毒E2蛋白A/D区单抗的制备及其抗原表位的初步研究

应用分子克隆技术将猪瘟病毒E2蛋白部分基因插入到载体pGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-4T-E（A）,在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白GST-E（A）,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆化和间接ELISA筛选,获得了C3、A1两株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA结果显示,其腹水效价为1∶128000和1∶256000。Western blotting结果证实,单克隆抗体C3和A1能与猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）发生特异性的反应,表明该单抗是针对猪瘟病毒E2蛋白的保守线性表位。