广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

2019-2022年中国H6N1亚型禽流感病毒的生物学特性分析

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区,是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配,并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段,产生新型重组病毒,进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究,为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省（直辖市、自治区）的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子,通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序,分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明,7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高,基因来源复杂,具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明,H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播,欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源,根据贝叶斯演化分析结果,推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成,后经野鸟传入我国。特殊氨...     

斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性及其流感病毒受体类型的研究

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009（H9N2）亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠咽拭子病毒分离阳性率为75%（6/8）,SPF鸡咽拭子病毒分离阳性率为100%（8/8）。攻毒后14d,斑鸠H9N2亚型禽流感病毒HI抗体阳性率为80%（4/5）,SPF鸡HI抗体阳性率为100%（5/5）。对H9N2亚型禽流感病毒受体检测结果表明,斑鸠的喉头、气管上段、中段、下段上皮细胞表面存在SAα2, 3Gal和SAα2, 6Gal两种连接键型的受体。【结论】斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/2/2009（H9N2）易感,且斑鸠的喉头和气管上、中、下段上皮细胞表面同时存在能够与禽流感病毒结合的SAα2, 3Gal受体和与人流感病毒结合的SAα2, 6Gal受体。     

A型流感病毒中国分离株PB1-F2基因进化分析

 【目的】明确国内鸡源H9N2禽流感病毒（AIV）的PB1-F2基因分子进化特征,并进一步全面了解国内A型流感病毒（IAV）流行株的PB1-F2的流行情况。【方法】对分离自北方发病鸡群中的14株H9N2亚型 AIV进行了PB1-F2基因的克隆和序列测定,并从GenBank数据库下载了禽源、猪源和人源H5N1和H9N2亚型AIV、人源和猪源H1N1和H3N2 IAV的PB1基因共计337个,系统的对国内不同宿主来源的IAV 的PB1-F2基因进行了分子进化分析。【结果】上述IAV的PB1-F2基因形成了6个不同的进化分支。推导的PB1-F2蛋白表现出长度的多态性,因IAV的HA类型和宿主来源的不同,其表达功能性PB1-F2蛋白的比率也存在差异。【结论】本研究明确了国内IAV 的PB1-F2基因的系统进化特征,为该基因功能的研究提供了分子流行病学资料。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株（SS株）进行交叉血凝抑制试验（HI）及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗（SS株）进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值（R）,结果发现A/chicken/Guan...     

H9亚型禽流感SPF鸡发病模型的构建

为了构建理想的H9亚型禽流感病毒(AIV) SPF鸡发病模型,对不同日龄SPF鸡、不同感染方法进行了预试验,最后选用SPF青年蛋鸡为试验动物,采用AIV H9N2毒株与大肠杆菌强毒株、IBV M41株各0. 5m L联合滴鼻感染的方法,进行了发病模型构建。结果表明,试验鸡发病症状明显、病变典型,这为进一步完成H9亚型禽流感防治药物的临床疗效评价奠定了基础。     

H9N2 AIV灭活疫苗免疫SPF鸡攻毒后肺组织免疫相关基因表达变化研究

[目的]本试验旨在探究H9N2亚型禽流感病毒攻击对H9灭活疫苗免疫SPF鸡呼吸系统的影响。[方法]选用36只3周龄SPF鸡,随机分为对照组(Con)、攻毒组(Flu)、免疫后攻毒组(Vac+Flu)。以每只0.4 mL剂量免疫接种H9灭活疫苗,3周后以10⁶ EID₅₀的病毒量进行攻毒,采集拭子、血清、气管、肺组织等样品,通过血凝抑制(HI)试验、RT-PCR、荧光定量PCR(qPCR)等方法检测血清中HI抗体滴度、肺脏流感病毒M基因拷贝数以及免疫相关基因CD4、CD8、GATA3、T-bet、IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ、Perforin、Granzyme、FasL、Fas等的表达量;并利用HE染色、免疫组织化学的方法观察气管、肺脏的病理变化及病毒特异性抗原NP蛋白的分布特征。[结果]HI试验结果显示,SPF鸡疫苗免疫后可产生较高的H9N2 AIV抗体效价。免疫保护试验和RT-PCR结果显示,SPF鸡疫苗免疫后攻毒仍能检测到机体排毒和流感病毒M基因在肺脏组织中的表达。HE染色和免疫组化结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后...     

H9亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)变异快、传染性强,由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果,导致H9N2亚型禽流感时有发生。为研发具有广谱保护性的H9亚型禽流感疫苗,本研究利用生物信息技术,对H9亚型AIV HA基因序列进行分析,设计获得HA基因序列。将HA基因构建于杆状病毒表达系统,表达的重组HA蛋白血凝效价为1×2¹²,与不同分支H9亚型AIV阳性血清具有良好的交叉反应活性。将重组蛋白制备成疫苗(rHA疫苗)免疫10日龄雏鸡,免疫后28 d将不同亚分支的H9亚型AIV流行毒株115和YZ株分别以1×10⁶EID₅₀(半数鸡胚感染量)感染试验鸡,rHA疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组。本研究结果表明H9亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景,可以用于防控H9 AIV感染。     

两株H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析

采用Pharmacia的TimesavecDNAsynthesisKit结合RT-PCR方法，测定从鸡中的分离的2株H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA全基因cDNA序列。结果表明这2株AIV和从香港地区鸡、鹌鹑中分离的3株H9N2亚型的AIV的亲源关系很近，HA的氨基酸同源性全部高于95％，可能是来源于同一毒株；而与2株从火鸡中分离的H9N2亚型的AIV的来源不同。     

不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析

 【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制（HI）和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现特殊的反应特性,单抗不能抑制3#和12#的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。HA蛋白氨基酸序列分析表明,3#和12#分离株145位氨基酸发生漂变（S→N）,导致与单抗的血凝抑制反应特性丢失,说明该位点（S145）为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,是血凝抑制抗体结合位点。S145N的漂变导致在145—147位氨基酸多出一个糖基化位点NGT,可能是分离株毒力增强的原因。【结论】本研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒呈现变异趋势,出现了有致病力和抗原性变异流行毒株。S145为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,但有该位点漂变导致的抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用,对该病的防控提出了新的挑战。     

中药制剂SHY对新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒的抑制和攻毒保护效果

本试验利用蔷薇科植物提取物（SHY）分别与新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒作用后,接种10 d SPF鸡胚,评价SHY对病毒的抑制作用;给21 d SPF鸡连续口服该中药提取物5 d后,分别用新城疫、禽流感病毒攻击,观察对SPF鸡的保护作用.结果表明：SHY测试剂量对SPF鸡胚没有毒性;20、10、5和2.5 mg/mL提取物与一定量的新城疫、禽流感H9亚型病毒作用后,鸡胚全部存活,病毒测定为阴性;与禽流感H5亚型病毒作用后,2.5 mg/mL组不能完全保护鸡胚存活（6/8）,病毒分离阳性.在攻毒试验中,SPF鸡分别按60、50、40和20 mg口服后,用新城疫和禽流感H9亚型攻毒保护分别为5/5、5/5、5/5和4/5.显示SHY不但能显著抑制新城疫、禽流感H9和H5亚型在鸡胚上增殖,而且能保护新城疫、禽流感H9亚型病毒的攻击.对SHY深入的研究,有望开发出有效抗禽流感药物.     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

犬源H9N2亚型流感病毒的遗传进化及其致病性分析

【目的】明确犬源H9N2亚型流感病毒的分子变异特征及致病性,为今后探究流感病毒的禽—犬跨种传播机制提供科学依据。【方法】从流浪犬中分离H9N2亚型流感病毒,利用RT-PCR扩增其8个基因节段进行BLAST同源比对,然后基于国内外的22株参考毒株进行遗传进化分析,并通过小鼠滴鼻感染试验评估分离毒株的致病性。【结果】从采集的393份犬鼻拭子样品中分离获得1株H9N2亚型流感病毒,命名为A/canine/Guangxi/LZ11/2018(简写为LZ11)。分离毒株LZ11为三重组毒株,其中,HA、NA和NS基因属于BJ/94类谱系,PB2和M基因属于G1类谱系,PB1、PA和NP基因属于F/98类谱系;病毒基因组成属于近年我国广泛流行的S基因型。分离毒株LZ11的HA蛋白在第324~331位存在1个裂解位点(PSRSSR↓GL),符合低致病性流感病毒的特征;HA蛋白还出现226Q→L突变,具有优先结合人类α-2,6唾液酸受体的能力;NA蛋白在119E、151D、276E、292R和294N未发生突变,但M2蛋白出现31S→N突变,说明分离毒株LZ11仍对神经氨酸酶抑制剂敏感,但已对金刚烷胺类药物产生耐药性;聚合酶蛋白出现多个哺乳动物适应性相关的氨基酸位点突变,包括PB2蛋白的292I→V、PB1蛋白的368I→V及PA蛋白的409S→N和356K→R。分离毒株LZ11虽然未引起小鼠出现典型的临床症状,但可在肺脏和上鼻窦有效复制,病毒滴度分别为3.82和5.98 lg PFU/mL。【结论】分离获得的犬源H9N2亚型流感病毒属于近年流行的S基因型,其8个基因节段分属于3种谱系(BJ/94类谱系、G1类谱系和F/98类谱系),且存在多个哺乳动物适应性相关氨基酸位点突变,具备感染哺乳动物的分子特征,可在小鼠脏器内有效复制。鉴于人类与宠物犬的密切关系,今后应加强对犬源H9N2亚型流感病毒的监测与防控。     

巴斯德毕赤酵母多拷贝整合表达组装禽流感病毒样颗粒

【目的】构建多拷贝整合表达禽流感病毒样颗粒的重组巴斯德毕赤酵母,为H5N1亚型禽流感基因工程疫苗提供基础。【方法】以巴斯德毕赤酵母GS115株18S rRNA基因(rDNA)部分序列,插入pPIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K。再以禽流感病毒H5N1毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒 p8K-HA/M/NA。表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞。增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株。阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物。【结果】PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白,免疫印迹试验可检测到与HA、M₁和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80~120 nm 的病毒样颗粒,免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体。【结论】重组毕赤酵母能够多拷贝整合、表达、组装禽流感病毒样颗粒。     

表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

【目的】将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS，构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5，以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。【方法】将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白，随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100 ?g和10 ?g剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后用100 LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白，载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI；免疫SPF鸡后，100?g pCAGGHA5可形成5/5的免疫保护，100?g pCIHA5可形成2/4的免疫保护，10?g pCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护，而10?g pCIHA5 则基本不能形成免疫保护，pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。【结论】鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。     

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。